トマトにおける細胞壁分解酵素の基質特異性と発現・機能解析

番茄细胞壁降解酶的底物特异性、表达及功能分析

基本信息

批准号：
18780025
负责人：
立石亮
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780025/
关键词：
トマト α-アラビノフラノシダーゼ β-キシロシダーゼ形質転換軟化

项目摘要

果実細胞壁の構造変化によって、その果実に特有の肉質を形成し、さらに、成熟・過熟時における進行は著しい品質の低下をもたらす。多数の細胞壁代謝酵素のうち、アラビノースの遊離に働くことが推定されるα-アラビノフラノシダーゼについて、特にglycoside hydrolase family 3に分類される本酵素について、クローニングと発現解析、リコンビナントタンパクを利用した基質特異性の検討、および、機能解析のための形質転換体の作成を行うことにより、園芸作物(トマト)における本酵素の役割を明らかにすることを目的とした。1.トマト果実からglycoside hydrolase family 3に分類されるα-アラビノフラノシダーゼをクローニングし、全長塩基配列を決定した。4種のクローンが得られ、それらの発現パターンは、発現ステージならびに発現部位が各々で異なっていた。したがって、トマトの生長や成熟の様々なステージでglycoside hydrolase family 3に分類されるα-アラビノフラノシダーゼが作用していることが推定された。2.得られた遺伝子について、異種細胞系を用いたタンパク発現システムを構築した。大腸菌をホストとした形質転換では活性を有する形でのタンパク質合成は起こらなかった。植物系培養細胞に導入したところ、4種のクローンのうち3種類ではα-アラビノフラノシダーゼ及びβ-キシロシダーゼ活性の2つを有する2機能性の酵素であることが確認された。1種類のクローンについては、人工基質への反応がみられず、α-アラビノフラノシダーゼ及びβ-キシロシダーゼの定義はできなかった。3.トマトに本酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入した組み換え体のトマトを作出した。

果实细胞壁的结构变化形成了果实特有的肉质质地，此外，随着果实的成熟和过熟，其品质显着恶化。在众多细胞壁代谢酶中，α-阿拉伯呋喃糖苷酶被认为与阿拉伯糖的释放有关，已使用重组蛋白将其作为底物进行了克隆、表达和分析，特别是这种酶，其被归类为糖苷水解酶家族 3。本研究的目的是通过检查其特异性并创建用于功能分析的转化体来阐明这种酶在园艺作物（番茄）中的作用。 1.从番茄果实中克隆α-阿拉伯呋喃糖苷酶，属于糖苷水解酶家族3，并测定了其全长核苷酸序列。获得了四种类型的克隆，它们的表达模式在表达阶段和表达位点上有所不同。因此，推测属于糖苷水解酶家族3的α-阿拉伯呋喃糖苷酶在番茄生长和成熟的各个阶段都有活性。 2.针对获得的基因构建利用异源细胞系统的蛋白表达系统。使用大肠杆菌作为宿主的转化没有导致活性蛋白质合成。当引入培养的植物细胞时，四个克隆中的三个被证实是具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-木糖苷酶活性的双功能酶。对于一类克隆，没有观察到对人工底物的反应，并且无法定义α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-木糖苷酶。 3.将该酶基因的反义基因导入番茄中，制成重组番茄。