β-グリカンを認識・結合する領域を利用する蛋白質二次元集積化法の開発研究

利用识别和结合β-聚糖的区域开发二维蛋白质整合方法的研究

• 批准号: 12019221
• 负责人: 森川 康
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019221/
• 关键词: セルロース結合領域; キシラン結合領域; トリコデルマ・リーセイ; セルラーゼ; α-L-アラビノフラノシダーゼ; キメラ体; エンドグルカナーゼIII; 協奏効果

本研究の目的はセルラーゼ等のβ-グリカン結合領域の特質を理解し、さらには蛋白質工学的に改変してβ-グリカンとの結合を自由自在に制御することであり、これによってバイオターゲッティング素子などにに利用するための知見を得ることである。糸状菌T.reeseiセルラーゼで唯一セルロース結合領域(CBD)を有しないEGIIIのN末端にCBHIのCBDおよびC末端にCBHIIのCBDをリンカーとともに結合させた2種のキメラ体を取得した。これらの結晶セルロースへの結合はnative EGIIIに比べ大幅に増加し、キメラ体のCBDが有効に機能することが明らかとなった。また、キメラEGIIIのリン酸膨潤セルロースや結晶セルロースなど不溶性基質に対する活性がnative EGIIIに比べ約1.5〜2.5倍に上昇した。動力学的な解析を行ったが、Kmだけではなくk_<cat>も増大していることが判明した。さらに、native EGIIIが協奏作用を示すCBHの共存下での結晶セルロース分解能力(協奏効果)を測定した結果、アビセル分解での協奏効果はnative EGIIIと変わらないのに対し、BMCC分解ではnative EGIIIの協奏効果(4.6倍)よりさらに増大し、最大で6.7倍となった。CBDの部位特異的変異は現在進行中である。T.reesei由来の全長53kDaのα-L-アラビノフラノシダーゼ(AF53)のC末端約18kDa部分にこれまでに報告のない新規なXBDが含まれていることが明らかになっている。そこで、AF53のC末端側を約9kDaから27kDaまで欠失させた3種類の変異遺伝子を構築した。現在これらの変異遺伝子をS.pombeのシグナル改良型分泌発現系で発現させている。今後、XBD単独で機能することを確認するとともに、XBDとしての最小領域を確定させる予定である。

本研究的目的是了解纤维素酶等的β-聚糖结合区域的特征，并进一步利用蛋白质工程对其进行修饰，以自由控制与β-聚糖的结合。用于各种目的。获得了两种类型的嵌合体，其中CBHI的CBD与EGIII的N端连接，CBHII的CBD与EGIII的C端连接，这是丝状真菌里氏木霉中唯一的纤维素酶没有纤维素结合域（CBD）。与天然 EGIII 相比，与这些结晶纤维素的结合显着增加，表明嵌合 CBD 有效发挥作用。此外，与天然EGIII相比，嵌合EGIII针对不溶性底物例如磷酸溶胀纤维素和结晶纤维素的活性增加了约1.5至2.5倍。我们进行了动态分析，发现不仅Km增加了，k_<cat>也增加了。另外，测定与表现出协同作用的CBH共存时的天然EGIII的结晶纤维素的分解能力(协同效应)，结果发现，Avicel分解中的协同效应与天然EGIII相同。 ，而在BMCC分解中，天然EGIII的这甚至比协同效应（4.6倍）增加得更多，达到最大值6.7倍。 CBD 的定点诱变目前正在进行中。据透露，源自里氏木霉的全长 53 kDa α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (AF53) 的 C 端约 18 kDa 部分含有一种以前未报道过的新型 XBD。因此，我们构建了三种类型的突变基因，其中AF53的C末端侧从约9kDa至27kDa被删除。我们目前正在使用粟酒裂殖酵母信号增强分泌表达系统来表达这些突变基因。未来，我们计划确认XBD独立运行，并确定XBD的最小面积。