β-グリカンを認識・結合する領域を利用した蛋白質二次元集積化法の開発研究

利用识别并结合β-聚糖的区域研究和开发二维蛋白质整合方法

基本信息

批准号：
11132218
负责人：
森川康
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的はセルラーゼ等のβ-グリカン結合領域を蛋白質工学的に改変して、β-グリカンとの結合を自由自在に制御することであり、これによってバイオ素子やバイオセンサーあるいはバイオターゲッティング素子に利用するための知見を得ることである。糸状菌T.reeseiセルラーゼで唯一セルロース結合領域(CBD)を有しないEG IIIのN末端にセロビオハイドロラーゼI(CBH I)のCBDを、またC末端にCBH IIのCBDを、リンカーとともに結合させた2種のキメラ体遺伝子を構築し、S.pombeで発現させたが、いずれもCMCを基質としたエンド型活性のある形で分泌発現された。これらを精製し、結晶セルロースヘの結合を確認後、各種基質に対する相対活性を測定したところ、特にCBH IのCBDをC末端に結合させたキメラEG IIIのBMCCに対する活性が大幅に上昇した。現在、これらの結果の動力学的な解析を行うとともに、native EG IIIが協奏作用を示すCBHの共存下での結晶セルロース分解能力などを測定することによって、CBDの特性(セルロースの認識・結合能)を評価している。T.reesei由来の全長53kDaのα-L-アラビノフラノシダーゼ(AF53)のC末端約18kDaが欠けた35kDaの短縮型酵素(AF35)は、低分子の合成基質には活性を示すにも拘わらず、高分子キシランに対する活性がなく、かつキシランに対する結合能も欠けており、C末端約18kDa部分にこれまでに報告のない新規なXBDが含まれていることが明らかになった。つぎに、AF53遺伝子をS.pombeで発現させた(27μg/m1)。現在、18kDa部分のC末端側をどこまで短縮すればキシラン結合能力が喪失されるかを検討している。今後、XBD単独で機能することを確認するとともに、N末端側を短縮させた変異体のキシラン結合能を検討することにより、XBDとしての最小領域を確定させる予定である。

本研究的目的是利用蛋白质工程修饰纤维素酶等的β-聚糖结合区域，以自由控制与β-聚糖的结合，这将使其能够用作生物装置、生物传感器或生物靶向装置。目标是获取可使用的知识。纤维二糖水解酶 I (CBH I) 的 CBD 连接到 EG III 的 N 末端，EG III 是丝状真菌里氏木霉中唯一不具有纤维素结合域 (CBD) 的纤维素酶，而 CBH 的 CBD II与接头一起连接到C末端，构建了两种类型的嵌合基因并在粟酒裂殖酵母中表达，但两者均使用CMC作为底物以具有内型活性的形式分泌和表达。纯化这些并确认它们与结晶纤维素的结合后，我们测量了它们针对各种底物的相对活性，特别是嵌合体 EG III 的针对 BMCC 的活性显着增加，其中 CBH I 的 CBD 与 C 末端结合。。目前，我们正在对这些结果进行动力学分析，并评估天然EG III在与CBH共存的情况下分解结晶纤维素的能力，这表现出协同作用。缺乏源自里氏木霉的全长 53kDa α-L-阿拉伯呋喃糖酶 (AF53) C 端 18kDa 的截短 35kDa 酶 (AF35) 不显示针对低分子合成底物的活性。然而，它没有针对高分子量木聚糖的活性并且缺乏木聚糖结合能力，并且已揭示C末端约18kDa区域包含迄今为止尚未报道的新型XBD。接下来，AF53 基因在粟酒裂殖酵母 (S. pombe) 中表达 (27 μg/ml)。我们目前正在研究 18kDa 部分的 C 末端应缩短到何种程度才能失去其木聚糖结合能力。未来，我们计划通过确认 XBD 单独发挥作用并检查 N 末端缩短的突变体的木聚糖结合能力来确定 XBD 的最小区域。