ニホンナシ果実の軟化関連酵素遺伝子の発現に関する研究

日本梨果实软化相关酶基因的表达研究

基本信息

批准号：
10760022
负责人：
立石亮
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760022/
关键词：
ニホンナシ軟化酵素遺伝子 β-ガラクトシダーゼ

项目摘要

果実の軟化には細胞壁分解酵素の関与が示唆されており、現在、いくつかの細胞壁分解酵素について研究が進められている。多くの種類の果実において、軟化に伴って細胞壁からアラビノースやガラクトースが遊離することが報告されており、これらの中性糖の遊離に関与すると考えられるβ-ガラクトシダーゼが注目されている。近年、数種の植物からβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が単離され、その塩基配列が明らかにされている。本研究では、これらの情報を元に、RT-PCR法によって、ニホンナシ果実からのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の単離を試みるとともに、その発現について検討した。材料には、ニホンナシ(豊水)を用い、果実の成熟ステージにしたがって経時的に採取した。果実組織よりトータルRNAを抽出し、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成し、それを鋳型にPCRによってβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を増幅した。また、RACE法によって5'の未知領域の配列を明らかにし、PCRによって全長のcDNAクローンを得た。デリーションクローンを作成し、全塩基配列を決定した。また、全長クローンをEco RI及びPst Iで切断した約700bpの断片をサブクローニングし、ジゴキシゲニンでラベルしたRNAプローブを作成し、ノーザン解析を行った。得られたクローンのORFは731のアミノ酸をコードしており、リンゴのβ-ガラクトシダーゼと98%の相同性がみられた。また、他の植物のβ-ガラクトシダーゼとも高い相同性を示した。得られたクローンは果実に特異的な発現を示し、かつ、成熟に伴ってその発現量が増大した。成熟に伴う発現量の増大は、ニホンナシ果実の中でも、軟化に重要と考えられているβ-ガラクトシダーゼIIIの活性の増大と一致した。以上から、得られたクローンはニホンナシの軟化に重要なβ-ガラクトシダーゼの遺伝子をコードしていることが示された。

细胞壁降解酶已被认为与果实软化有关，目前正在对几种细胞壁降解酶进行研究。据报道，许多类型的水果在软化时，其细胞壁会释放出阿拉伯糖和半乳糖，而被认为参与这些中性糖释放的β-半乳糖苷酶引起了人们的关注。近年来，从多种植物中分离出β-半乳糖苷酶基因，并揭示了其核苷酸序列。在本研究中，基于这些信息，我们尝试使用RT-PCR从日本梨果实中分离β-半乳糖苷酶基因并研究其表达。以日本梨（Hosui）为材料，根据果实的成熟阶段随时间收集材料。从果实组织中提取总RNA，使用oligo dT引物合成cDNA，并以此为模板通过PCR扩增β-半乳糖苷酶基因。此外，通过RACE法确定5'未知区域的序列，并通过PCR获得全长cDNA克隆。创建了缺失克隆并确定了整个碱基序列。另外，用Eco RI和Pst I消化全长克隆，亚克隆约700bp的片段，制备地高辛标记的RNA探针，并进行Northern分析。获得的克隆的ORF编码731个氨基酸，与苹果β-半乳糖苷酶同源性为98%。它还与其他植物的β-半乳糖苷酶表现出高度同源性。获得的克隆表现出果实特异性表达，并且表达水平随着成熟而增加。随着成熟，表达水平的增加与β-半乳糖苷酶III活性的增加相一致，β-半乳糖苷酶III被认为对于日本梨果实的软化很重要。由上可知，所获得的克隆编码对于日本梨的软化而言重要的β-半乳糖苷酶基因。