枯草菌胞子形成期におけるDNA再編成

枯草芽孢杆菌孢子形成阶段的 DNA 重排

• 批准号: 06780554
• 负责人: 佐藤 勉
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780554/
• 关键词: 枯草菌; DNA組換え; 胞子形成; 細胞分化; DNA再編成; 遺伝子発現; プロモーター; DNA結合タンパク質

in vivoの実験結果からspoIVCAの転写に関与することが示唆されたSpoIIIDタンパク質を大腸菌内で大量に発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製をおこなった。このタンパク質のspoIVCA上流領域への結合能をDNaseIフットプリンティング法により調べた結果、-14〜-34の領域にSpoIIIDが結合することが明らかとなった。次に枯草菌のT_3の細胞より精製したEδ^Eを用いて、spoIVCAを鋳型としたin vitro転写系に、SpoIIIDタンパク質を添加した。この結果、spoIVCAの転写産物はEδ^Eのみを添加した場合では検出されず、Eδ^EとSpoIIIDを添加した場合にのみ検出された。これらの結果より、枯草菌胞子形成期におこるDNA再編成に関与するspoIVCAの転写はEδ^EとSpoIIIDにより正に制御されていることがin vitroにおいても明らかとなった。さらに、spoIVCA以外のEδ^Eで転写される遺伝子群(spoIID,spoVE)の発現に対するSpoIIIDの関与を調べるために、SpoIIIDを用いたDNaseIフットプリンティング、in vitro転写実験をこれらの遺伝子のプロモーターを含むDNA断片を用いておこなった結果、SpoIIIDはspoIID,spoVEの転写を負に調節していることが明らかとなった。また、spoIVCAのプロモーターを枯草菌で誘導可能なspacプロモーターに置き換えた融合遺伝子を染色体上に構築し、spoIVCAを栄養増殖期に強制発現させ、DNA再編成の有無を調べた。この結果、DNA再編成がおこらず、DNA再編成に直接関与するSpoIVCA以外の因子が胞子形成期特異的に存在することが示唆された。この因子はSpoIIIDである可能性があり現在解析をおこなっている。

根据体内实验结果表明SpoIIID蛋白参与spoIVCA转录，该蛋白在大肠杆菌中大量表达并通过柱层析纯化。通过DNaseI足迹法研究了该蛋白与spoIVCA上游区域结合的能力，结果表明SpoIIID与-14至-34区域结合。接下来，使用从枯草芽孢杆菌T_3细胞中纯化的Eδ^E，将SpoIIID蛋白添加到以spoIVCA为模板的体外转录系统中。结果，仅添加Eδ^E时未检测到spoIVCA的转录物，而仅添加Eδ^E和SpoIIID时才检测到spoIVCA的转录物。这些结果表明，即使在体外，参与枯草芽孢杆菌孢子形成过程中 DNA 重排的 spoIVCA 的转录也受到 Eδ^E 和 SpoIIID 的正向调节。此外，为了研究 SpoIIID 在除 spoIVCA 之外的 Eδ^E 转录基因（spoIID、spoVE）的表达中的参与，我们使用 SpoIIID 进行了 DNaseI 足迹分析，并使用 DNA 片段进行了涉及这些基因启动子的体外转录实验。研究表明，SpoIIID 负向调节 spoIID 和 spoVE 的转录。此外，我们在染色体上构建了一个融合基因，其中spoIVCA启动子被枯草芽孢杆菌诱导的spac启动子取代，在营养生长期强制表达spoIVCA，并检查是否存在DNA重排。结果，DNA重排没有发生，表明除了SpoIVCA之外直接参与DNA重排的因素在孢子形成阶段特异存在。该因素可能是SpoIIID，目前正在分析中。

项目成果

T.Sato,K.Harada,Y.Ohta,Y.Kobayashi: "Expression of the Bacillus subtilis spoIVCA gene,which encodes a site specific recombinase,depends on the spollGB product." Journal of Bacteriology. 176. 935-937 (1994)

T.Sato、K.Harada、Y.Ohta、Y.Kobayashi：“枯草芽孢杆菌 spoIVCA 基因（编码位点特异性重组酶）的表达取决于 spollGB 产品。”