Chkチロシンキナーゼによるリン酸化と細胞周期制御機構との関連についての研究

Chk酪氨酸激酶磷酸化与细胞周期调控机制关系的研究

基本信息

批准号：
17790049
负责人：
中山祐治
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

ChkはCskチロシンキナーゼとともにCskファミリーを構成しており,機能および構造的にこれらは類似している。しかしながらCskが細胞核内には分布しないのに対し,Chkは核にも分布する。本年は,Chkの核局在に関与するドメインについて検討した。また,核局在型変異体を用い,細胞増殖に与える影響について解析した。1.Chkチロシンキナーゼの核局在に関与するドメインの検索:ChkはCskには存在しないN末端ドメインを持つ。このN末端ドメインを持つ野生型とN末端ドメインを欠失した変異体を用い,核への局在の違いについて検討した。培養細胞への過剰発現では局在に差が認められなかったので,核への結合性を顕微鏡下で調べることが可能な実験系を構築した。この方法を用い検討した結果,N末端ドメインをもつ野生型Chkが,N末端ドメイン欠失変異体よりも強く核へ結合するのを観察した。これはN末端ドメインが核に結合することを示唆しており,N末端ドメインのみで核への結合性を示す結果も得られた。2.核結合配列の探索:N末端ドメインをさらに前半後半に分け,核への結合性を検討した結果,後半部分に結合配列が含まれることを見出した。3.核マトリックスへの結合:細胞核を界面活性剤,DNaseI,硫安,2M NaClで順次処理して核マトリックスを調製した。N末端ドメインは核マトリックスに結合した。4.核マトリックスのリン酸化:遺伝子導入によりChkを発現させた細胞から核マトリックスを調製し,チロシンリン酸化を蛍光顕微鏡により調べた結果,Chkの発現により核マトリックスのリン酸化の亢進が観察された。5.Chkチロシンキナーゼの核局在と細胞増殖に与える影響:核局在型Chk変異体を発現させると細胞増殖を抑制した。核の形態変化と細胞周期S期の遅延が観察された。

CHK与CSK酪氨酸激酶一起构成了CSK家族，功能和结构特征相似。但是，尽管CSK未分布在细胞核中，但CHK也分布在核中。今年，我们检查了与CHK的核站有关的领域。此外，我们使用核型突变体分析了对细胞增殖的影响。 1。搜索CHYKK酪氨酸激酶核站涉及的域：CHK具有CSK中不存在的N末端结构域。使用野生型与该N末端结构域和失去N末端结构域的突变体，我们检查了对核的定位差异。由于培养细胞的定位没有差异，因此建立了可以检查显微镜下与核的结合的实验系统。由于检查了这种方法，我们观察到，具有N末端结构域的野生CHK与N末端结构域更强烈地与核武器结合。这表明N末端结构域与核结合，并且仅与N末端结构域结合了核的结果。 2。在寻找核混合物阵列：N末端结构域进一步分为上半场的上半场，并且由于检查了与核的结合，因此发现下半场包括结合序列。 3。与核基质的键：核基质是通过用表面活性剂，dnasei，硫酸盐和2M NaCl处理细胞核来制备的。 N末端结构域与核基质键合。 4。核基质磷酸化：通过遗传引入表达CHK的细胞制备核基质，并通过荧光显微镜检查酪氨酸氧化，并且已经观察到CHK的表达以增强核基质氧化。 5。核站和CHK酪氨酸激酶的细胞增殖的影响：核站型CHK突变体的出现抑制了细胞增殖。观察到核形态变化和细胞周期周期s的延迟。