超音波を利用したin vitroおよびin vivoでの遺伝子導入の増強

使用超声波增强体外和体内基因转移

基本信息

批准号：
04F02550
负责人：
田畑泰彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)非ウィルスベクターの創製遺伝子は負電荷をもつアニオン性の高分子であり、細胞表面の負電荷との斥力により、そのままでは細胞内へ導入することはほとんど不可能である。本研究では、カチオン性高分子を用いて、遺伝子とポリイオンコンプレックスを形成させることによって、全体としての電荷を正しく、遺伝子の分子サイズを低下させ、細胞への遺伝子導入率の向上を試みた。まず、細胞との親和性の高い水溶性高分子である、ゼラチンあるいは細胞接着に関係するペプチド配列をもつプロネクチンFに対して、カチオン性のエチレンジアミンあるいはスペルミンを化学導入した。得られたカチオン化水溶性高分子と遺伝子との複合体について、表面電荷や分子サイズなどの物理化学的性質を調べたところ、期待通り、分子サイズが約200nmの正に帯電したポリイオンコンプレックスが形成されていることが分かった。(2)細胞の接着環境および培養方法が遺伝子導入に与える影響細胞の接着環境を変化させるために、異なる3種類の3次元足場材料を作製した。すなわち、ポリエチレンテレフタレート(PET)繊維からなる不織布、コラーゲンスポンジ、およびポリグリコール酸(PGA)繊維を用いてコラーゲンスポンジの力学的特性を改善したPGA-コラーゲン複合スポンジである。これらの3次元足場材料へ(1)で作製したカチオン化水溶性高分子と遺伝子とのポリイオンコンプレックスを含浸させることによって、遺伝子を坦持した3次元足場材料を得た。骨髄から単離した間葉系幹細胞(MSC)をこの足場材料内で培養したところ、MSCは増殖することが分かった。次に、 MSCに遺伝子-カチオン化ゼラチンコンプレックスを与え、培養したところ、MSCへの遺伝子導入が認められた。次に、あらかじめ、コンプレックスを坦持させた、3次元足場材料へMSCを播種した。通常の静置培養に加えて、旋回培養あるいは還流培養法で細胞を培養したところ、還流培養法が、他の培養法に比べて、遺伝子導入率、発現レベルの高いことが分かった。

（1）非病毒载体的遗传基因是负电荷的阴离子聚合物，并且由于细胞表面负电荷的排斥力，几乎不可能像它们那样将其引入细胞。在这项研究中，我们试图通过使用阳离子聚合物与基因形成Polyion复合物，以纠正总体电荷，减少基因的分子大小并提高基因转移到细胞中。首先，将阳离子乙二胺或精子化学介绍到pronectin f中，pronectin f是一种具有高亲和力的水溶性聚合物，其细胞具有明胶或与细胞粘附相关的肽序列。检查了阳离子水溶性聚合物与基因之间的复合物的物理化学特性，例如表面电荷和分子大小，并且正如预期的那样，形成了一个带正电荷的Polyion复合物，分子大小为200 nm。（2）细胞粘附环境和培养方法对基因转移的影响三种不同类型的3D脚手架材料已准备好改变细胞的粘附环境。也就是说，它是一种PGA-胶原复合材料海绵，它使用由聚对苯二甲酸酯（PET）纤维，胶原蛋白海绵和聚乙醇酸（PGA）纤维制成的非织造织物来改善胶原蛋白海绵的机械性能。通过将这些3D支架材料浸入（1）和基因制备的阳离子水溶性聚合物之间的Polyion络合物中，获得了带有基因的3D支架材料。从骨髓中分离出的间充质干细胞（MSC）在这种支架材料中培养，发现MSC会生长。接下来，给出了MSC并培养的基因化明胶复合物，并观察到基因转移到MSC中。接下来，将MSC提前播种成三维脚手架材料，并带有配合物。除了通常的静态培养外，还使用漩涡或反流培养方法培养细胞，发现反流培养方法比其他培养方法具有更高的基因转移速率和表达水平。