超音波と薬物ターゲティングとを組み合わせた遺伝子導入のin vivo増強法

结合超声和药物靶向的体内增强基因转移方法

基本信息

批准号：
13218064
负责人：
田畑泰彦
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

カチオン化反応の条件を変えることによって、異なるカチオン化率をもつカチオン化ゼラチンを作製した。電気泳動法によって、カチオン化ゼラチンとプラスミドDNAとの複合体形成について評価したところ、カチオン化率が40%以上の場合、カチオン化ゼラチン/プラスミドDNAの混合比が5以上で複合体の形成できることがわかった。カチオン化率の低い場合には、混合比を上げることによって、複合体は形成された。複合体の表面電荷を調べたところ、プラスミドDNAの電荷-60mVは複合体化により+10mVと正電荷に反転した。これらの複合体のサイズは約100nmであり、複合体比によらず、ほぼ一定であった。プラスミドDNA-カチオン化ゼラチン複合体を細胞とともに培養し、種々の条件で超音波照射を行った。細胞のプラスミドDNAの発現および生存率について調べた結果、超音波照射を行うことにより、遊離プラスミドDNAおよび複合体ともに、遺伝子発現は増強された。しかしながら、後者の増強効果は前者より有意に高くなっていた。超音波の照射時間は長いほうが遺伝子発現の増強作用は強くなったが、照射時間の増加とともに細胞の生存率は低下する傾向があり、照射時間においては、発現増強効果に対するoptimalな時間のあることがわかった。複合体のみでは、その量によらず細胞毒性は示さなかった。複合体をマウスの大腿筋へ投与し、その投与部位に超音波照射を行った後のプラスミドDNAの発現を調べた結果、遊離プラスミドDNAに比較して、複合体の方が発現は有意に高くなった。また、その発現は、超音波照射によりさらに増強された。超音波照射のエネルギーおよび照射時間の増加とともに、プラスミドDNAの発現の増強効果は高まり、その発現期間の延長も認められた。これに対して、遊離プラスミドDNAの場合には、超音波による増強効果は複合体に比べて小さかった。

通过改变阳离子反应的条件，产生具有不同阳离子化速率的阳离子明胶。当通过电泳评估阳离子明胶和质粒DNA的复合物形成时，发现当阳离子化速率为40％或以上时，当阳离子明胶/质粒DNA的混合比为5或更多时，可以形成复合物。在低阳离子速率的情况下，通过增加混合比来形成复合物。当检查复合物的表面电荷时，质粒DNA的电荷-60mV被反转至 +10mV，因此由于络合而导致正电荷。这些配合物的大小约为100 nm，无论复合比的比例如何，几乎是恒定的。将质粒DNA诱导的明胶复合物与细胞一起培养，并在各种条件下进行超声辐照。由于研究了细胞中质粒DNA的表达和存活率，超声辐射增强了自由质粒DNA和复合物中的基因表达。但是，后者的增强效应显着高于前者。超声辐射时间的越长，增强基因表达的效果越强，但是随着辐射时间的增加，细胞的存活率倾向于降低，发现表达增强作用的最佳时间是最佳的时间。无论含量多少，复合物都不会显示出细胞毒性。在给药部位将复合物对小鼠大腿肌肉和超声照射的质粒DNA的表达表明，与游离质粒DNA相比，该复合物的表达明显更高。超声照射进一步增强了表达。随着超声照射的能量和辐照时间的增加，质粒DNA表达的增强效果增加，表达周期也延长了。相反，在自由质粒DNA的情况下，超声的增强效应小于复合物。