超音波を利用したin vitroおよびin vivoでの遺伝子導入の増強

使用超声波增强体外和体内基因转移

• 批准号: 02F00550
• 负责人: 田畑 泰彦
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00550/
• 关键词: 遺伝子導入; 非ウィルス性遺伝子キャリア; 超音波照射; ターゲティング; カチオン性水溶性高分子; 金属配位結合; 非ウイルス性遺伝子キャリア

(1)非ウイルスベクターの創製遺伝子は負電荷をもりアニオン性の高分子であり、細胞表面の負電荷との斥力により、そのままでは細胞内へ導入することは困難である。本研究では、カチオン性高分子を用いて、遺伝子とポリイオンコンプレックスを形成させることによって、細胞への遺伝子導入を試みた。まず、細胞との親和性の高い水溶性高分子である、ゼラチンあるいは細胞接着に関係するペプチド配列をもつプロネクチンFに対して、カチオン性のエチレンジアミンあるいはスペルミンを化学導入した。得られたカチオン化水溶性高分子と遺伝子との複合体について、分子サイズや表面電荷などの物理化学的性質を調べたところ、分子サイズが約200nmの正に帯電したポリイオンコンプレックスが形成されていることがわかった。(2)細胞の接着環境および培養方法が遺伝子導入に与える影響細胞の接着環境を変化させるために、異なる3種類の三次元足場材料を作製した。すなわち、ポリエチレンテレフタレート(PET)繊維からなる不織布、コラーゲンスポンジ、およびポリグリコール酸(PGA)繊維を用いてコラーゲンスポンジの力学的特性を改善したPGA-コラーゲン複合スポンジである。これらの三次元足場材料へ、(1)で作製したカチオン化水溶性高分子と遺伝子とのポリイオンコンプレックスを含浸させることによって、遺伝子を担持した三次元足場材料を得た。現在、骨髄から単離した間葉系幹細胞(MSC)をこの足場材料内で培養することによって、MSCへの遺伝子導入が可能かどうかについて検討しているところである。また、遺伝子を担持した異なる三次元足場材料へ播種したMSCを用いて、通常の静置培養に加えて、旋回培養あるいは還流培養することにより、細胞に対する酸素・栄養・老廃物の交換、あるいは流体力学的刺激などが遺伝子導入に与える影響について検討している。

(1)非病毒载体的制作基因是带负电荷的阴离子聚合物，由于与细胞表面负电荷的排斥作用，很难将其直接导入细胞内。在这项研究中，我们尝试通过使用阳离子聚合物与基因形成聚离子复合物，将基因引入细胞中。首先，将阳离子乙二胺或精胺通过化学方法引入到明胶（一种对细胞具有高亲和力的水溶性聚合物）中，或引入到 Pronectin F（具有与细胞粘附相关的肽序列）中。当检查所得的阳离子化水溶性聚合物和基因的复合物的分子大小和表面电荷等物理化学性质时，发现形成了分子大小约为200nm的带正电的聚离子复合物。 (2)细胞粘附环境和培养方法对基因转移的影响为了改变细胞粘附环境，制备了三种不同类型的三维支架材料。即，它是采用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维、胶原蛋白海绵、聚乙醇酸(PGA)纤维制成的无纺布来提高胶原蛋白海绵的机械性能的PGA-胶原蛋白复合海绵。通过用(1)中制备的阳离子化水溶性聚合物和基因的聚离子复合物浸渍这些三维支架材料，获得携带基因的三维支架材料。我们目前正在研究是否有可能通过在这种支架材料中培养从骨髓分离的间充质干细胞（MSC）来将基因引入其中。此外，通过将间充质干细胞接种在携带基因的不同三维支架材料上，除了正常的静态培养外，还可以采用旋转培养或灌注培养，为细胞交换氧气、营养物质和废物，或改善液体流动。我们正在研究机械刺激对基因转移的影响。

项目成果

Hosseinkahni, H., Aoyama, T., Ogawa, O., Tabata, Y.: "Liver targeting of plasmid DNA by pullulan with metal coordination"J. Control. Release.. 83(2). 287-302 (2002)

Hosseinkahni，H.，Aoyama，T.，Okawa，O.，Tabata，Y.：“普鲁兰多糖与金属配位对质粒 DNA 的肝脏靶向”J。

Hosseinkahni, H., Aoyama, T., Yamamoto, S., Ogawa, O., Tabata, Y.: "In vitro transfection of plasmid DNA by amine derivatives of gelatin accompanied with ultrasound irradiation"Pharm. Res.. 19(10). 1469-1477 (2002)

Hosseinkahni，H.，Aoyama，T.，Yamamoto，S.，Okawa，O.，Tabata，Y.：“通过明胶胺衍生物伴随超声照射体外转染质粒 DNA”Pharm。

Hosseinkahni, H., Tabata, Y.: "In vitro gene express ion by cationized derivatives of an artificial protein with repeated RGD sequences, Pronectin"J. Control. Release. (in press).

Hosseinkahni, H., Tabata, Y.：“通过具有重复 RGD 序列的人工蛋白的阳离子化衍生物进行体外基因表达，Pronectin”J.

Hosseinkhani, H., Tabata, Y.: "In vitro gene expression by cationized derivatives of an artificial protein with repeated RGD sequences, Pronectin【○!R】."J.Control.Release.. 86(1). 169-182 (2003)

Hosseinkhani, H., Tabata, Y.：“通过具有重复 RGD 序列的人工蛋白的阳离子化衍生物进行体外基因表达，Pronectin【○！R】。”J.Control.Release.. 86(1)。 (2003)

Hosseinkahni, H., Aoyama, T., Ogawa, O., Tabata, Y.: "Tumor targeting of gene expression through metal-coodinated conjugation with dextran"J. Control. Release.. (in press).

Hosseinkahni，H.，Aoyama，T.，Okawa，O.，Tabata，Y.：“通过与葡聚糖的金属配位缀合实现基因表达的肿瘤靶向”J。