細胞内カルシウム動態に関わる新規機能分子の構造と機能の解析

细胞内钙动力学相关新型功能分子的结构和功能分析

基本信息

批准号：
03F03778
负责人：
御子柴克彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03778/
关键词：
IP_3R IRBIT NBC リン酸化プルダウン実験免疫組織ビアコア装置細胞内pH

项目摘要

イノシトール三リン酸レセプター(IP_3R)は細胞の小胞体膜に存在しIP3による情報伝達で細胞内にカルシウムを放出する重要なチャネルレセプターである。当研究室ではこのIP3Rが受精、卵の活性化、ニューロンの突起伸展、欠損動物はてんかんを起こすこと、脳の可塑性に関わることを明らかにしてきた。そこで私は新規に見いだされたIP_3Rに結合するタンパク質であるアービット(IRBIT)およびそのIRBIT結合タンパク質のナトリウム/炭酸水素イオンの共トランポーター(NBC)の結合部位の同定および生理学的機能解明を行った。IRBITとNBCが結合する際、IRBITはリン酸化されていることが必須条件であることが明らかとなった。次にどのリン酸化部位が結合に重要であるかを検討した。IRBITのN末端付近の52,58,62,64,66,68,70,71,72,74,76,77,80,90,97番目のセリンをアラニン残基にしたポイントミューテーションを用いた。その結果、第68,71,74,77番目のセリン残基を改変したものが結合しないことをプルダウン実験より明らかにした。このリン酸化IRBITとNBCの結合はさらにビアコア装置を使って詳しく解析した。NBCには3種類のアイソフォームが存在し特異的認識抗体を供与または購入し、免疫組織で組織内および細胞内での局在を検討した。IRBITに結合するNBCは小脳に特徴的な局在が観察された。IRBITはアフリカツメガエルの卵母細胞での強制発現系ではNBCを膜に輸送しトランスポーター活性を7倍以上も上昇させることを明らかにした。さらにこのNBCの活性を哺乳類の細胞で測定するために細胞内pH変化を指標に検討する系を立ち上げた。

肌醇三磷酸受体（IP_3R）是一个重要的通道受体，它位于细胞内质网膜中，并通过IP3信号传导将钙释放到细胞中。我们的实验室表明，IP3R参与了受精，卵子激活，神经元突起，失踪动物的癫痫和脑可塑性。因此，我鉴定了结合位点，并阐明了新发现的蛋白IRIT（IRIT）的生理功能，以及其含有含量结合蛋白的钠/碳酸氢盐共转孢子虫（NBC）。已经揭示了IRBIT和NBC结合时，必须将IRBIT磷酸化至关重要。接下来，我们研究了哪些磷酸化位点对于结合很重要。点突变在丝氨酸位于52、58、62、64、66、68、70、71、72、72、74、76、77、77、80、90和97位附近的N-末端作为丙氨酸残基附近。结果，下拉实验表明，位置68、71、74和77处的丝氨酸残基改变没有结合。使用BIACORE装置详细分析了该磷酸化的IRIT和NBC的结合。 NBC有三种同工型，并捐赠了特定的识别抗体，并在免疫学中检查了组织和细胞中的定位。与IRBIT结合的NBC在小脑中具有独特的定位。 IRBIT表明，爪蟾卵母细胞中的强迫表达系统将NBC转移到膜上，并使转运蛋白活性增加了7倍以上。此外，启动了一个系统，以使用细胞内pH变化作为指标检查NBC在哺乳动物细胞中的活性。