ミエリン形成障害ミュ-タントにおけるオリゴデンドロサイト変性脱落の機構の解明

阐明髓鞘形成受损突变体少突胶质细胞变性和脱落的机制

基本信息

批准号：
01480155
负责人：
御子柴克彦
金额：
$ 2.62万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至 1990
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝性にミエリン形成障害を示すジンピ-マウスにおいてはミエリンの主要構成蛋白質であるプロテオリピド蛋白(PLP)の遺伝子内に点突然変異が見い出されており、ミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイト(ODC)が変性脱落する。本研究において、遺伝子導入を通してその治療を試みた。まず、ジンピ-変異を同定する遺伝子診断法を開発した。すなわち、ジンピ-変異の両側をはさむようにオリゴヌクレオチドを合成し、その領域をPolymerase Chain Reaction(PCR)法により増幅した。ポリアクリルアミド電気泳動後メンブランにトランスファ-し、オリゴヌクレオチドプロ-ブで検出することにより、野生型とジンピ-型の識別ができるようになった。次に、PLPの発現ベクタ-を用いてトランスジェニックマウスを作製した。マウスPLP遺伝子のプロモ-タ-領域とポリA付加部位を持ち、間にラットPLP cDNAを含んだPLPミニジ-ンを構築し、マウス受精卵前核に注入した。生まれて来た24匹のトランスジェニックマウスを解析したが外来性のPLPミニジ-ン由来のPLPを発現しているマウスはいなかった。この理由としてPLP発現ベクタ-に発現に必須な領域を充分に含んでいなかったことが考えられるのでPLP全遺伝子をクロ-ニングし、トランスジェニックマウスを作製し直すことを計画した。Lorist Bコスミドベクタ-を用いてマウスジェノミックライブラリ-を作製しPLP cDNAおよびPLP遺伝子の5′、3′末端に対応する合成オリゴヌクレオチドでスクリ-ニングしたところ、5′上流領域20kb、3′下流領域5kbを含んだPLP全遺伝子をクロ-ニングすることに成功した。現在、このものを用いてトランスジェニックマウスを作製中である。この系が確立されれば導入するPLP遺伝子を改変することによりPLP異常とオリゴデンドロサイトの変性脱落との関連が推察できると思われる。

在髓磷脂形成中表现出遗传性损伤的杜松子小鼠中，在蛋白质蛋白质（PLP）的基因中发现了点突变，髓磷脂的主要成分蛋白和髓磷脂形成细胞的细胞少突胶质细胞（ODC）被定位。在这项研究中，尝试通过基因转移尝试治疗。首先，开发了一种遗传诊断方法来鉴定杜松子大突变。也就是说，合成寡核苷酸，以与杜松子突变的两侧相交，并通过聚合酶链反应（PCR）方法扩增该区域。聚丙烯酰胺电泳后，将其转移到膜上并用寡核苷酸探针检测，从而使野生型和杜松子类型被区分。接下来，使用PLP的表达矢量生成转基因小鼠。构建了一个含有大鼠PLP cDNA的PLP minijenin，其中包含小鼠PLP基因的启动子区域和Polya添加位点，在其中将大鼠PLP cDNA注入了小鼠受精卵的蛋黄核中。我们分析了24只生小鼠，但它们都没有表达出源自外源性PLP微调的PLP。这被认为是PLP表达载体不包含足够的表达区域的原因，因此我们计划克隆所有PLP基因并重新产生转基因小鼠。使用Lorist B cosmid载体制备小鼠基因组文库，并用与PLP基因的5'和3'端相对应的合成寡核苷酸筛选，并能够成功克隆所有包含20 kb上游区域和3'3'下游区域的PLP基因。当前使用该产品生产转基因小鼠。如果建立了该系统，则可以通过改变引入的PLP基因来推断PLP异常和贬低少突胶质细胞之间的关系。