細胞内カルシウム動態に関わる新規機能分子の構造と機能の解析

细胞内钙动力学相关新型功能分子的结构和功能分析

基本信息

批准号：
03F00778
负责人：
御子柴克彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00778/
关键词：
IP_3R IRBIT 免疫沈降プルダウン実験 NBC1

项目摘要

IP_3Rに結合する新規のタンパク質を同定し、アービット(IRBIT)と名付け2003年に発表した。このIRBITに結合する物質を抗体を用いてマウスの小脳から同定した結果、ナトリウム/炭酸水素共トタンスポター(NBC1)に相当するアミノ酸配列が検出された。その結果を基にNBC1とIRBITの結合様式を明らかにすることにした。NBC1抗体によるIRBIT結合の確認NBC1には3種のタイプが存在するが、その3種とも脳内で発現している。免疫沈降実験の結果、pNBCとbNBCがIRBITと結合することが明らかとなった。kNBCが結合しなかったことからpNBCとbNBCに存在しkNBCにはないN末領域のアミノ酸部分がIRBITに結合するのだろうと類推された。NBC/IRBIT/IP_3R三量体形成NBCもIP_3Rと同様にIRBITが結合することから、脳内でこの3つの分子がコンフォメーションを形成している可能性が考えられた。そこでマウス小脳で抗NBC抗体を用いて免疫沈降実験を行った結果、IP3Rも共沈してくることが確認された。さらに強制発現蛋白質でのプルダウン実験でも同じ結果が得られ、その上IP3RとNBCは直接には結合せずIRBITを介して始めて結合が確認された。強制発現NBCタンパク質でのプルダウン実験NBC1-MBPタンパク質の強制発現ベクターを作製し作為的に合成した蛋白質とIRBITとの結合確認実験を行った。コントロールにはpNBCにMBPを結合させたタンパク質を用い、N末端側の領域が重要であることを示すために1残基から88残基目のアミノ酸を含むpNBCとbNBCには共通領域だがkNBCには存在しないタンパク質を用いて共沈してくるIRBITの量を測定した。その結果、N末端領域は全長のタンパク質と同等量のIRBITに結合し、その領域が結合部位である確証が得られた。

鉴定了与IP_3R结合并称为IRBIT的一种新型蛋白质，并于2003年发表。使用抗体在小鼠小脑中鉴定出与IRIT结合的物质，并检测到对应于钠/二碳酸盐盐二烷酸（NBC1）的氨基酸序列。根据结果，我们决定阐明NBC1和IRBIT的结合模式。确认NBC1抗体的IRBIT结合有三种类型的NBC1，并且所有三种均在大脑中表达。免疫沉淀实验表明，PNBC和BNBC与IRIT结合。由于KNBC没有结合，因此可以推断出存在于PNBC和BNBC中的N末端区域的氨基酸部分，而不是KNBC中的氨基酸部分与IRIT结合。由于NBC中的IRBIT/IP_3R三聚体形成，因此IRBIT与NBC结合，就像IP_3R一样，因此认为这三个分子在大脑中形成构象。因此，使用小鼠小脑中的抗NBC抗体进行了免疫沉淀实验，并证实IP3R也会复位。此外，在表达强制蛋白的下拉实验中获得了相同的结果，并且首先通过IRBIT确认结合，而无需直接在IP3R和NBC之间结合。制备了NBC1-MBP蛋白的强制表达的NBC蛋白A强制表达载体的下拉实验，并在人为合成的蛋白和IRIT之间进行了结合确认实验。使用与PNBC结合的MBP的蛋白质用作对照，并证明N末端区域很重要，使用含有1到88个残基的蛋白质氨基酸的含量的IRBIT量，但对于PNBC和BNBC来说是常见的，但在KNBC中不存在。结果，N末端区域与等效量的IRBIT作为全长蛋白，证实该区域是结合位点。