細胞内カルシウム動態に関わる新規機能分子の構造と機能の解析

细胞内钙动力学相关新型功能分子的结构和功能分析

基本信息

批准号：
03F00778
负责人：
御子柴克彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00778/
关键词：
IP_3R IRBIT 免疫沈降プルダウン実験 NBC1

项目摘要

IP_3Rに結合する新規のタンパク質を同定し、アービット(IRBIT)と名付け2003年に発表した。このIRBITに結合する物質を抗体を用いてマウスの小脳から同定した結果、ナトリウム/炭酸水素共トタンスポター(NBC1)に相当するアミノ酸配列が検出された。その結果を基にNBC1とIRBITの結合様式を明らかにすることにした。NBC1抗体によるIRBIT結合の確認NBC1には3種のタイプが存在するが、その3種とも脳内で発現している。免疫沈降実験の結果、pNBCとbNBCがIRBITと結合することが明らかとなった。kNBCが結合しなかったことからpNBCとbNBCに存在しkNBCにはないN末領域のアミノ酸部分がIRBITに結合するのだろうと類推された。NBC/IRBIT/IP_3R三量体形成NBCもIP_3Rと同様にIRBITが結合することから、脳内でこの3つの分子がコンフォメーションを形成している可能性が考えられた。そこでマウス小脳で抗NBC抗体を用いて免疫沈降実験を行った結果、IP3Rも共沈してくることが確認された。さらに強制発現蛋白質でのプルダウン実験でも同じ結果が得られ、その上IP3RとNBCは直接には結合せずIRBITを介して始めて結合が確認された。強制発現NBCタンパク質でのプルダウン実験NBC1-MBPタンパク質の強制発現ベクターを作製し作為的に合成した蛋白質とIRBITとの結合確認実験を行った。コントロールにはpNBCにMBPを結合させたタンパク質を用い、N末端側の領域が重要であることを示すために1残基から88残基目のアミノ酸を含むpNBCとbNBCには共通領域だがkNBCには存在しないタンパク質を用いて共沈してくるIRBITの量を測定した。その結果、N末端領域は全長のタンパク質と同等量のIRBITに結合し、その領域が結合部位である確証が得られた。

确定并在2003年宣布了与IP_3R结合的新蛋白质。由于使用抗体鉴定出与该含有这种含有的物质结合的物质结合的结果，检测到与钠/碳酸锡锡摄氏（NBC1）相当的氨基酸序列。根据结果，我们决定阐明NBC1和IRBIT的结合方式。与NBC1抗体键合的确认具有三种类型的NBC1，但三个抗体都在大脑中表达。免疫沉积实验的结果，发现PNBC和BNBC与IRIT结合。假定KNBC没有结合，并且存在于PNBC和BNBC中的N-端区域中的氨基酸部分将与IRIT结合。 NBC/IRBIT/IP_3R三重形式的NBC（例如IP_3R）与IP_3R相同，因此认为这三个分子在大脑中形成一个组成。因此，已经证实，IP3R将由于使用小鼠小脑中的抗-NBC抗体进行免疫沉积实验而下沉。此外，在用强制表达蛋白的拉力下实验中获得了相同的结果，并且首次通过IRBIT确认键，而无需直接结合IP3R和NBC。创建了强制表达NBC蛋白下拉实验NBC1-MBP强制表达素的蛋白质表达载体，并进行了蛋白质和IRBIT之间的结合实验，并积极合成。该对照是由将MBP与PNBC结合在一起的蛋白质制成的，并且为了表明N端侧的区域很重要，它是PNBC和BNBC的常见区域，它含有1至88个残基的氨基酸。测量使用非存在蛋白质的IRBIT量下沉。结果，N末端区域与IRIT结合，IRIT等同于整体蛋白质，并已证实该区域是关节位点。