有機フッ素化合物のバイオコンバージョン:フッ素脱離・導入の酵素触媒機構と応用

有机氟化合物的生物转化：酶催化除氟机理/介绍及应用

基本信息

批准号：
14703021
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 18.39万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14703021/
关键词：
フルオロ酢酸デハロゲナーゼ有機フッ素化合物脱ハロゲン 2-ハロアクリル酸レダクターゼ有機ハロゲン化合物不斉還元 Burkholderia 2-クロロプロピオン酸フルオロ酢酸 2-ハロ酸 2-ハロ酸デハロゲナーゼ

项目摘要

1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼの構造と機能フルオロ酢酸デハロゲナーゼはフルオロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、グリコール酸を与える。脂肪族フッ素化合物の強固な炭素-フッ素結合の切断を触媒する唯一の既知酵素である。本酵素はフルオロ酢酸を最も良好な基質とするが、クロロ酢酸にも、その4%の活性を示す。本酵素反応では、触媒中心アスパラギン酸残基の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を求核攻撃し、ハライドイオンが脱離するとともに、酵素と基質が共有結合したエステル中間体が生成する。続いてヒスチジン残基が活性化した水分子によって中間体が加水分解され、グリコール酸が遊離するとともに、触媒中心アスパラギン酸残基が再生する。本研究では、Burkholderia sp.FA1が生産する本酵素の構造と機能を解析した。結晶構造解析によって活性部位に存在することが示されたアミノ酸残基を部位特異的変異法で改変し、触媒能への影響を調べた。触媒中心のAsp104、His271のほか、これらの近傍に存在するArg105、His149、Arg108、Tyr147、Phe34、Tyr212、Phe272、His103をアラニン残基に改変すると、フルオロ酢酸とクロロ酢酸のいずれに対する活性も消失した。一方、Trp150をアラニン残基に改変した酵素では、クロロ酢酸に対する活性は野生型酵素の71%残存したにもかかわらず、フルオロ酢酸に対する活性は完全に消失した。Trp150はフッ化物イオンの脱離に必須の役割を果たすことが示された。2.2-ハロアクリル酸レダクターゼの発見と機能解析2-クロロアクリル酸資化性菌Burkholderia sp.WSが、NADPHを還元剤として2-ハロアクリル酸の不斉還元を触媒する新奇酵素2-ハロアクリル酸レダクターゼを生産することを明らかにした。本酵素と補酵素再生系を組み合わせることにより、除草剤の原料として有用な(S)-2-クロロプロピオン酸を効率よく生産することに成功した。

1.氟乙酸脱卤酶的结构和功能氟乙酸脱卤酶催化氟乙酸水解脱卤反应生成乙醇酸。它是唯一已知的催化脂肪族氟化合物中强碳-氟键断裂的酶。该酶的最佳底物是氟乙酸，但它对氯乙酸也显示出 4% 的活性。在该酶促反应中，催化中心天冬氨酸残基的侧链羧基对底物的α-碳进行亲核攻击，消除卤离子，生成酶与底物共价的酯中间体已生成绑定。随后，中间体被组氨酸残基激活的水分子水解，释放乙醇酸并在催化中心再生天冬氨酸残基。在本研究中，我们分析了伯克霍尔德杆菌FA1产生的这种酶的结构和功能。通过定点诱变对晶体结构分析显示存在于活性位点的氨基酸残基进行修饰，并研究其对催化活性的影响。除了催化中心的Asp104和His271之外，当它们附近存在的Arg105、His149、Arg108、Tyr147、Phe34、Tyr212、Phe272和His103被修饰为丙氨酸残基时，对氟乙酸和氯乙酸的活性消失.另一方面，在Trp150被修饰为丙氨酸残基的酶中，尽管对氯乙酸的活性仍为野生型酶的71％，但对氟乙酸的活性完全消失。 Trp150 在氟离子解吸中发挥重要作用。 2. 2-卤代丙烯酸酯还原酶的发现和功能分析一种新型酶2-卤代丙烯酸酯还原酶，通过2-氯代丙烯酸酯同化细菌Burkholderia sp.WS，以NADPH为还原剂催化2-卤代丙烯酸酯的不对称还原。。通过将该酶与辅酶再生系统相结合，我们成功地高效生产了可用作除草剂原料的(S)-2-氯丙酸。