封入体形成を抑制する低温タンパク質生産システムの開発

开发抑制包涵体形成的低温蛋白质生产系统

基本信息

批准号：
16658044
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、生態系の理解や未知遺伝子資源の開拓を目的として、環境ゲノム情報が急速に明らかにされつつある。地球上の生物圏の80%以上が深海や極地等の低温環境であることを考えると、環境ゲノムがコードするタンパク質の多くが熱安定性の低い低温活性タンパク質であると推測される。低温活性タンパク質の多くは、大腸菌等を宿主とした常温での発現系では生産が難しい。そこで本研究では、南極海水より単離された低温菌Shewanella libingstonensis Ac10を宿主とし、低温でタンパク質を生産する系の開発を行った。本菌の最適増殖温度は18℃であるが、4℃でも良好に生育する。我々は本菌の全ゲノム配列をほぼ明らかにしており、ゲノム情報に基づいた生産系の構築・改良が可能である。まず、本菌を宿主として複製するコスミドベクターを見いだし、形質転換法を確立した。さらに、本菌のタンパク質を二次元電気泳動で解析し、高生産されているものを同定した。そのプロモーターを上記ベクターに組み込んで発現ベクターを構築した。本生産系の有用性を確かめるため、好冷菌Desulfotalea psychrophila由来の酵素タンパク質の生産を行った。D. psychrophilaは至適温度10℃の好冷菌であり、その保持するタンパク質の多くが熱に不安定であると推測される。そこでD.psychrophila由来のoligoendopeptidase, aminopeptidase, prolidase, β-glucosidaseを18℃で発現させた。その結果、4種類とも可溶性タンパク質として高生産された。prolidaseとβ-glucosidaseについては、大腸菌を宿主とした場合、低温(18℃)で培養しても、ほとんど生産されなかった。以上の結果から、本生産系が低温環境由来等の熱安定性の低いタンパク質の生産に適していることが示唆された。

近年来，为了理解生态系统和开创性未知基因的目的而迅速揭示了环境基因组信息。考虑到地球上有80％以上的生物领域是一个低温的环境，例如深海或极地土地，因此可以推测许多编码环境基因组的蛋白质是低温度和低温度的蛋白质热稳定性。许多低温活性蛋白在室温下难以生产，这种蛋白使用大肠杆菌作为宿主。因此，在这项研究中，我们使用了从南极海水分离出的低 - 橡树shewanella libingstonensis ac10，该系统在低温下生产蛋白质。该细菌的最佳增殖温度为18°C，但在4°C下生长良好。我们几乎阐明了该细菌的所有基因组序列，并且可以根据基因组信息构建和改善生产系统。首先，我们发现了将细菌复制为宿主的宇宙矢量，并建立了一种转化方法。此外，通过两个维电泳和高价的蛋白质分析了该细菌的蛋白质。启动子被纳入上面的向量并建立了一个表达向量。为了确认该生产系统的有用性，我们生产了源自脱硫酸脂蛋白衍生的细菌的酶蛋白。 D. Chertrophila在10°C的最佳温度下是一种很好的冷细菌，并且假定许多要保持的蛋白质对于热量不稳定。因此，在18°C中表达了衍生自d.pssercyrophila的寡肽酶，氨基肽酶，催化酶，β-葡萄糖苷，β-葡萄糖苷，β-葡萄糖苷酶的表达。结果，所有四个均作为可溶性蛋白产生。即使大肠杆菌是宿主时，衍生酶和β-葡萄糖苷酶也很少在低温（18°C）培养。上述结果表明，该生产系统适合于低稳定性的生产，例如低温环境等。