微生物のハロ酸デハロゲナーゼの分子生物学的研究と応用

微生物卤酸脱卤酶的分子生物学研究及应用

基本信息

批准号：
05760069
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲンを触媒する2-ハロ酸デハロゲナーゼ(DEX)には立体特異性が異なる4種(L-DEX、D-DEX、DL-DEX(立体保持型)、DL-DEX(立体反転型))が知られている。このうち、L-DEX、DL-DEX(立体反転型)の構造と機能を解析した。1.土壌細菌PseudomonasspYLからL-DEXを精製し、これが高い耐熱性を有していること、また、有機溶媒中、炭素鎖長16の長鎖の基質にも作用することを明らかにした。同じ菌株が生産するDL-DEX(立体反転型)の精製及び諸性質の検討も行った。2.L-DEX遺伝子の塩基配列を決定した。翻訳領域は696塩基からなり、232アミノ酸をコードしていた。これは他生物由来のL-DEX及びハロ酢酸デハロゲナーゼと38-57%の高い相同性を示した。一方、立体特異性を異にするD-DEXや、基質特異性を異にするハロアルカンデハロゲナーゼとは有意な相同性はなかった。3.クローン化したL-DEX遺伝子を、Escherichia coliJM109に導入し、全可溶蛋白質の約50%という非常に高い効率で本酵素を生産する組換え体を得た。この組換え体から、熱処理とイオン交換クロマトグラフィーのみで簡便に本酵素を均一に精製する方法を確立した。4.3.で大量に精製した酵素を用い、15%PEG8000、1%n-プロパノールを沈殿剤として、良質な結晶を得ることができた。:5.L-DEXはAsp,Gluの化学修飾で失活した。他生物由来のL-DEXとの間で完全に保存されている5箇所のAsp、1箇所のGluを部位特異的変異法により、Asn、Glnにそれぞれ改変した。その結果、10位及び180位のAsp残基を改変した変異酵素において著しい活性低下が認められ、これらの触媒反応への関与が示唆された。

催化 2-卤酸水解脱卤的 2-卤酸脱卤酶 (DEX) 有四种类型（L-DEX、D-DEX、DL-DEX（立体保留型）和 DL-DEX），具有不同的立体特异性。 (立体反转型))是已知的。其中，对L-DEX和DL-DEX（空间反转型）的结构和功能进行了分析。 1.我们从土壤细菌PseudomonasspYL中纯化出L-DEX，发现它具有很高的耐热性，并且在有机溶剂中也作用于碳链长度为16的长链底物。我们还纯化了同一菌株产生的DL-DEX（空间倒转型）并检查了其性质。 2.确定L-DEX基因的核苷酸序列。翻译区由696个碱基组成，编码232个氨基酸。它与来自其他生物的L-DEX和卤乙酸脱卤酶表现出38-57%的高度同源性。另一方面，与具有不同立体特异性的D-DEX和具有不同底物特异性的卤代烷脱卤素酶没有显着同源性。 3.将克隆的L-DEX基因导入大肠杆菌JM109中，获得重组体，该重组体以非常高的效率产生该酶，约占总可溶性蛋白的50%。从该重组体中，我们建立了一种简单的方法，仅使用热处理和离子交换层析即可均匀纯化该酶。使用4.3中大量纯化的酶并使用15％PEG8000和1％正丙醇作为沉淀剂，我们能够获得高质量的晶体。：5.L-DEX 通过天冬氨酸和谷氨酸的化学修饰而失活。与来自其他生物的L-DEX完全保守的5个Asp位点和1个Glu位点通过定点诱变分别被修饰为Asn和Gln。结果，在第 10 和 180 位天冬氨酸残基被修饰的突变酶中观察到活性显着降低，表明这些酶参与了催化反应。