フルオロ酢酸デハロゲナーゼによる炭素-フッ素結合の切断機構

氟乙酸脱卤酶裂解碳氟键的机制

基本信息

批准号：
08760080
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Moraxella sp.B由来のフルオロ酢酸デハロゲナーゼH-1は各種ハロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、グルコール酸を生成する酵素であり炭素-フッ素結合の加水分解的開裂を触媒できる唯一の酵素である。本研究では、環境浄化等に有用なデハロゲナーゼの分子設計を行うことを目標に、本酵素の触媒機構と触媒中心残基の役割を検討した。ハロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応の機構としては、酸性アミノ酸残基の側鎖カルボキシル基の求核攻撃によって生成するエステル中間体を経由するものと、塩基性残基に活性化された水分子が基質を直接攻撃するものとの2つが考えられる。本研究では、エステル中間体経由の反応を触媒する既知の酵素との比較から、本酵素においてそれぞれ求核残基、水分子活性化残基、ハロゲン引き抜き残基に対応すると推測されたAsp105、His272、Arg106の機能を解析した。まずH_2^<18>O中で反応を行った野生型酵素をトリプシンで分解し、Asp105を含むペプチド断片をタンデムMS/MS法で分析したところ、Asp105に^<18>Oが取り込まれていた。また本酵素は、基質共存下で、水分子よりも強い求核性をもつヒドロキシルアミンと濃度依存的な失活を起こした。一方、H272N変異酵素を基質と反応させると酵素の分子量が約58増加し、^<14>C標識した基質と反応させると酵素分子に放射活性の取り込みが見られた。またArg106の変異により基質特異性が変化した。以上の結果、本酵素反応では、まずAsp105の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を求核攻撃してハライドイオンが脱離し、次いで、酵素と基質からなるエステル中間体が溶媒の水分子によって加水分解されると考えられた。そして、水分子の活性化にはHis272の、ハロゲン引き抜きにはArg106の関与がそれぞれ示唆された。

Moraxella sp.b的氟去二硫化酶H-1是唯一可以催化碳氟键的水解的酶，碳氟键是一种产生葡萄糖酸的酶，这是对各种Halo actate的各种卤素反应的催化。在这项研究中，我们研究了该酶的催化机理和催化中心残基的作用，目的是设计Dehaall再生酶的分子设计，这对于环境纯化很有用。至于卤代乙酸的氢解去除卤素反应的机制，酯中间体激活的分子是由酸性氨基酸残基的亚karboxyl发作产生的，而分子被基本残基激活直接攻击基板的事物。在这项研究中，基于与已知酶的已知酶相比，该研究中假定与怀旧残基，水分子活化残基和无卤素的残基相兼容的ASP105，HIS272，该酶与无卤素兼容的残留物，该酶催化了中间中等中间体的反应的已知酶分析了Arg106的功能。首先，在H_2^<18> O中响应的野生型酶被胰蛋白酶分解，并通过串联MS/MS方法分析了含有ASP105的肽片段，ASP105纳入了ASP105。该酶还引起羟胺比水分子强，并且在共存下密度依赖性密度。另一方面，当H272N突变酶对底物反应时，酶的分子量增加了约58个，而与^<14> CEDE的反应时，酶分子已在酶分子中导入。由于ARG106的突变，底物的特异性发生了变化。结果，在这种酶反应中，首先，横向离子受到ASP105侧链羧基的底物的α-碳的攻击，然后将卤化物离子分开，然后是溶剂，溶剂是溶剂，该溶剂是酯中间体的溶剂由酶和底物组成。在水分子的激活中提出了HIS272的参与，而Arg106参与卤素的参与。