X線結晶構造解析及び、部位特異的変異法によるキサンチン脱水素酵素の構造・機能の研究

利用X射线晶体结构分析和定点突变研究黄嘌呤脱氢酶的结构和功能

• 批准号: 13770063
• 负责人: 岡本 研
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770063/
• 关键词: キサンチン脱水素酵素; キサンチン酸化酵素; X線結晶構造解析; 部位特異的変異法; 阻害剤

キサンチン脱水素酵素はヒトにおいてはプリン分解系の最終段階を触媒する酵素であり、キサンチンを尿酸に代謝する。もう一方の基質はNADであるが、酵素分子の高次構造の変化により、酸素を基質とするキサンチン酸化酵素へ変換することが知られている。このとき酵素反応の生成物として生ずる活性酸素が虚血再還流障害などの組織障害の原因となっているという多くの報告がある。本研究期間においては、結晶構造解析と部位特異的変異酵素の機能の解析を更に進めることにより、キサンチン脱水素酵素、酸化酵素の活性酸素生成機構に焦点を当て、これを解明中である。1)酵素(部位特異的変異酵素も含む)と基質アナログ、阻害剤との複合体の結晶構造の解析を行い、活性中心付近の反応メカニズムの推測を行った。より正確な議論を行うため、現在得られている結晶構造についても結晶化条件を改良するなどして分解能を高め、リファインメントを続けている。2)結晶構造より推測された活性酸素生成機構上重要であると考えられるアミノ酸残基を適宜変換した部位特異的変異酵素の作成を行う。FADと酸素との反応性を制御していると考えられる鉄硫黄中心のリガンド、あるいはその周辺のアミノ酸残基についても変換酵素の作成を行った。これら変異酵素について分光学的測定と、酵素学的解析(種々の基質、阻害剤に対するキネティカルなデータの収集、ストップドフローなどによる速度論的解析)を行い、既に得られている天然型酵素のデータとの比較を行うことによりFADにおける活性酸素生成機構に対する周囲アミノ酸の影響を解析中である。

黄嘌呤脱氢酶是催化人类嘌呤降解系统的最后阶段，并将黄氨酸代谢为尿酸。另一个底物是NAD，已知可以通过改变酶分子的结构来转化为黄嘌呤氧化酶，该氧化酶将氧气用作底物。目前，已经有许多报道称，作为酶反应的产物产生的活性氧是组织损伤的原因，例如局部缺血 - 逆转损伤。在这一研究期间，我们通过进一步分析定点突变酶的功能并阐明它们，将重点放在黄嘌呤脱氢酶和氧化酶的机制上。 1）我们分析了酶（包括位于定位的突变酶），底物类似物和抑制剂之间复合物的晶体结构，并推测了在活性中心附近的反应机制。为了进行更准确的讨论，通过改善结晶条件并改善分辨率并继续完善的结晶条件，可以改善当前获得的晶体结构。 2）通过适当转化氨基酸残基来创建一个位置定向的突变酶，这些氨基酸残基被认为在从晶体结构中推断出的活性氧的机理中很重要。还将酶转化为铁硫中心的配体，该中心被认为调节了FAD和氧的反应性，或者对周围的氨基酸残基的反应性。通过光谱测量和酶促分析（使用各种底物和抑制剂，停止流量等）分析周围氨基酸对FAD中活性氧产生机制的影响，并与先前获得的天然酶数据进行比较。

项目成果

Okamoto K, Eger BT, Nishino T, Kondo S, Pai EF, Nishino T.: "An extremely potent inhibitor of xanthine oxidoreductase. Crystal structure of the enzyme-inhibitor complex and mechanism of inhibition."Journal of Biological Chemistry. 278,3. 1848-1855 (2003)

Okamoto K、Eger BT、Nishino T、Kondo S、Pai EF、Nishino T.：“一种极其有效的黄嘌呤氧化还原酶抑制剂。酶-抑制剂复合物的晶体结构和抑制机制。”生物化学杂志。