キサンチン酸化酵素における非ヘム鉄の機能に関する研究

非血红素铁在黄嘌呤氧化酶中的作用研究

• 批准号: 10770054
• 负责人: 岡本 研
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770054/
• 关键词: キサンチン脱水素酵素; キサンチン酸化酵素; 鉄硫黄中心; xanthine dehydrogenase; iron-sulfur center

キサンチン脱水素酵素の鉄硫黄中心のリガンドと考えられるシステイン残基をセリンへと変換した組み換えウイルス数種の作製に成功した。すでに構築されている昆虫細胞発現系を用いて変異酵素の発現を行った。さらに大腸菌による発現酵素を得るための試みとして、ドメインごとの発現系の構築を行い、解析を行っている。得られた数種の変異酵素について精製法を確立し、数ミリグラムの精製標品を得るに至った。これらの精製した変異酵素についてEPRスペクトルの測定を行った。2種の変異酵素とも2種の鉄硫黄中心センターに由来するシグナルが認められ、システインに替わってセリンがリガンドとなっていることが推測された。このEPR測定によって2個の鉄硫黄中心それぞれを形成するモチーフが推定できた。さらにカナダ、トロント大との共同研究により本酵素のX線結晶構造が明らかにされ、本研究の結果と併せて各々の鉄硫黄中心の立体構造上の位置、他の補酵素のと距離が明らかになった。このことより、酵素活性における分子内電子伝達の経路、FADの反応性に対する鉄硫黄中心の関与、活性酸素生成のメカニズムについて重要な知見が得られた。現在はこれらの変異酵素について酸化還元滴定、種々の基質を用いた活性測定など、更なる解析を行っている。

我们成功地产生了几种重组病毒，这些病毒已从半胱氨酸残基转化为丝氨酸，这些病毒被认为是黄嘌呤脱氢酶铁硫心中心的配体。使用已经构建的昆虫细胞表达系统表达突变酶。此外，为了获得大肠杆菌表达的酶，构建和分析了每个域的表达系统。为获得的几种突变酶建立了一种纯化方法，从而制备了几毫克。测量了这些纯化的突变酶的EPR光谱。两种突变酶均显示出源自两个铁硫中心的信号，并被推测丝氨酸是配体而不是半胱氨酸。这种EPR测量使我们能够估计形成两个铁硫中心中每个中每个的基序。此外，与加拿大和多伦多大学的一项联合研究揭示了该酶的X射线晶体结构，以及本研究的结果，每个铁硫中心的构象位置以及其他辅酶之间的距离。这为分子内电子转移的途径提供了重要发现，在酶活性中，铁硫中心参与FAD反应性和活性氧的机理。当前，正在对这些突变酶进行进一步的分析，包括使用各种底物进行氧化还原滴定和活性测量。

项目成果

Ichimori K., Fukahori M., Nakazawa H., Okamoto K. and Nishino T.: "Inhibition of xanthine oxidase by nitric oxide" Journal of Biological Chemistry. in press.

Ichimori K.、Fukahori M.、Nakazawa H.、Okamoto K. 和 Nishino T.：“一氧化氮对黄嘌呤氧化酶的抑制”生物化学杂志。

C. Enroth, B.T.Eger, E.F. Pai, K. Okamoto, T. Iwasaki, T. Nishino, and T. Nishino: "Favins and Flavoproteins(S. Ghisla et al, eds.): Crystal structure of xanthine oxidoreductase and EPR assignment of Fe/S center."RUDOLF WEBER AGENCY FOR SCIENTIFIC PUBLICA

C. Enroth、B.T.Eger、E.F. Pai、K. Okamoto、T. Iwasaki、T. Nishino 和 T. Nishino：“Favins 和黄素蛋白（S. Ghisla 等人编辑）：黄嘌呤氧化还原酶的晶体结构和 EPR 分配

T. Nishino, K. Okamoto, H. Hori, A. Kounosu, T. Nishino: "Favins and Flavoproteins(S. Ghisla et al, eds.): The Mechanism of Conversion from Xanthine Dehydrogenase to Oxidase of Rat Enzyme Studied by Site-Directed Mutagenesis."RUDOLF WEBER AGENCY FOR SCIEN

T. Nishino、K. Okamoto、H. Hori、A. Kounosu、T. Nishino：“Favins 和黄素蛋白（S. Ghisla 等编辑）：通过位点研究的大鼠酶从黄嘌呤脱氢酶转化为氧化酶的机制

T. Iwasaki, K. Okamoto, T. Nishino, J. Mizushima, H. Hori, and T. Nishino: "Sequence Motif-specific Assignment of Two[2Fe-2S] Clusters in Rat Xanthine Oxidoreductase by Site-derected Mutagenesis"J. Bichem.. (in press).

T. Iwasaki、K. Okamoto、T. Nishino、J. Mizushima、H. Hori 和 T. Nishino：“通过定点诱变对大鼠黄嘌呤氧化还原酶中两个 [2Fe-2S] 簇进行序列基序特异性分配”J

K. Ichimori, M. Fukahori, H. Nakazawa, K. Okamoto and T. Nishino: "Inhibition of xanthine oxdase and xanthine dehydrogenase by nitric oxide; nitric oxide converts reduced xanthine oxidizing enzymes into the desulfo-type inactive form."J. Biol. Chem.. 274.

K. Ichimori、M. Fukahori、H. Nakazawa、K. Okamoto 和 T. Nishino：“一氧化氮抑制黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤脱氢酶；一氧化氮将还原的黄嘌呤氧化酶转化为脱硫型非活性形式。”