キサンチン酸化酵素における非ヘム鉄の機能に関する研究

非血红素铁在黄嘌呤氧化酶中的作用研究

• 批准号: 08770092
• 负责人: 岡本 研
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770092/
• 关键词: キサンチン酸化酵素; キサンチン脱水素酸素; 非ヘム鉄; バキュロウイルス

大量発現系の構築について申請書に記載した昆虫細胞による大量発現系の構築については完成をみた。和研薬社のセルマスターシステムの導入より1.5リッター規模という昆虫細胞としては大規模な発現系を安定して運用することが可能となった。また、通常のスピナ-フラスコを用いてもほぼ同規模の培養が可能な体制となった。組み換えウイルスの作製についてキサンチン脱水素酵素の[2Fe-2S]センターのリガンドと考えられるシステイン残基をセリンへと変換した組み換えウイルス数種の作製に成功した。また、それら変異酵素を解析して得られた結果をふまえて新たな変異酵素の作製に入っている。変異酵素の解析について得られた2種の変異酵素(C51S、C115S)について精製法を確立し、数ミリグラムの精製標品を得るに至った。これらの精製した変異酵素についてEPRスペクトルの測定を行った。2種の変異酵素とも2種の[2Fe-2S]センターに由来するシグナルが認められ、システインに替わってセリンがリガンドとなっていることが推測された。この結果に基づき、非ヘム鉄を完全に欠失した変異酵素を得るため、上記システイン残基をセリンではなくアラニンへと変換した変異酵素(C51A,C115A)を現在作製中である。このEPR測定によって2個の[2Fe-2S]センターについてそれぞれを形成するモチーフが推定できた。現在はこれらの変異酵素について酸化還元滴定、種々の基質を用いた活性測定など、更なる解析を行っている。

关于大规模表达系统的构建，如应用程序中所述，使用昆虫细胞的大规模表达系统的构建已完成。随着Waken Yakuhyaku的细胞主系统的引入，已经有可能针对昆虫细胞的大规模表达系统，该系统的大小为1.5升。此外，该系统已经确定，即使使用常规旋转器瓶也可以在相同的尺度上进行培养。关于重组病毒的产生，通过转化半胱氨酸残基成功产生了几种重组病毒，这些病毒被认为是木氨酸脱氢酶的[2FE-2S]中心的配体，成丝氨酸。此外，根据分析这些突变酶获得的结果，正在产生新的突变酶。分析突变酶为两种突变酶（C51和C115）建立了一种纯化方法，从而产生了几毫克纯化的制剂。测量了这些纯化的突变酶的EPR光谱。对于两个突变酶，观察到源自两个[2FE-2S]中心的信号，据推测丝氨酸是配体而不是半胱氨酸。基于此结果，为了获得一种突变酶，该酶完全删除了非血红素的突变酶（C51A，C115A），其中正在生产上述上述半胱氨酸残基而不是丝氨酸而不是丝氨酸。这种EPR测量使我们能够估计形成两个[2FE-2]中心中每个中心的基序。当前，正在对这些突变酶进行进一步的分析，包括使用各种底物进行氧化还原滴定和活性测量。

项目成果

西野朋子,岡本研,他3名: "バキュロウイルス発現系によるキサンチン脱水素酵素の蛋白翻訳後の機能発現" 生化学. 68,7. 638- (1996)

Tomoko Nishino、Ken Okamoto 和其他 3 人：“使用杆状病毒表达系统进行黄嘌呤脱氢酶的翻译后功能表达”，生物化学 68,7。

Takeshi Nishino,他8名: "Conversion of Xanthine Dehydrogenase to oxidase and its role of rapurfasion injury" Biochem.Socie.Trans.(1997)

Takeshi Nishino 等人：“黄嘌呤脱氢酶向氧化酶的转化及其对 rapurfasion 损伤的作用”Biochem.Socie.Trans.(1997)

中西茂子,西野朋子,岡本研,他3名: "昆虫細胞により発現したキサンチン酸化酵素の性質の検討(II)" 生体機能における金属イオンの特異的作用の分子科学. 42- (1996)

Shigeko Nakanishi、Tomoko Nishino、Ken Okamoto 等 3 人：“昆虫细胞表达的黄嘌呤氧化酶的特性研究（II）”金属离子对生物功能的特定影响的分子科学 42-（1996）。

西野朋子,岡本研,他4名: "昆虫細胞により発現したキサンチン酸化酵素の性質の検討(I)" 生体機能における金属イオンの特異的作用の分子科学. 41- (1996)

Tomoko Nishino、Ken Okamoto 等 4 人：“昆虫细胞表达的黄嘌呤氧化酶特性的研究（I）”金属离子对生物功能的特定影响的分子科学 41-（1996）。

岡本研,他4名: "発現した非ヘム鉄キサンチン脱水素酵素の性質" 生化学. 68,7. 638- (1996)

Ken Okamoto 和其他 4 人：“表达的非血红素铁黄嘌呤脱氢酶的特性”，生物化学 68,7- (1996)。