遺伝子組み換えバベシア原虫の作製法の確立とその応用

转基因巴贝斯虫原虫生产方法的建立及其应用

基本信息

批准号：
13760204
负责人：
横山直明
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、バベシア原虫体内に異種の標的遺伝子を含む発現カセットを導入し、それらを原虫遺伝子内に組み込ませることで目的の蛋白質を恒常的に発現しうる遺伝子組み換え原虫の作製法を確立することにあった。まず、真核細胞用CAG promoter、Toxoplasma gondiiのGRA1 promoter、もしくはBabesia bovisのRAP-1 promoterを上流に添えたenhanced green fluorescent protein (EGFP:蛍光発色蛋白質)発現カセットを含む3種類のtransfer vectorを構築し、エレクトロポレーション法によりBabesia bovis虫体内に遺伝子の導入を試みた。その結果、T. gondiiのGRA1 Promoter付きEGFP vectorを導入したバベシア原虫のみ、明瞭な蛍光色を細胞質内から発する陽性像を観察した。しかしながら、そのような陽性原虫の出現率は約0.01%と低く、また遺伝子導入後4日目にはその陽性蛍光像が完全に消失してしまったことから、更なる改良が必要とされた(Fujii et al.,J. Protozool. Res.投稿中)。次に、薬剤耐性遺伝子として知られるTgDHFR-Ts遺伝子を活用して遺伝子導入原虫を選抜し、陽性原虫の回収効率を向上させる試みを行った。そこではまず、TgDHFR-Ts蛋白質が耐性能を示す薬剤Pyrimethamineのバベシア原虫に対する増殖阻害効果が調べられた。その結果、IC_<50>、0.8-3.2μg/mlでPyrimethamineがパペシア原虫の試験管内増殖を有意に抑えることが示された(Nagai et al.,Antimocrob. Agents chemother.,2003)。そのため、Pyrimethamine耐性TgDHFR-Ts遺伝子及びEGFP遺伝子を共発現できる新たなTransfer vectorを構築し、Pyrimethamine選択下でのEGFP遺伝子発現B. bovis原虫の出現率及びその発現性状を現在検討している。以上の成果から、1)エレクトロポレーション法によりTransfer vectorを原虫内に導入できること、2)T. gondiiのGRA1 promoterによって外来遺伝子をバベシア原虫体内で発現させることができること、3)一過性ではあるが、外来遺伝子EGFPをバベシア原虫体内で発現できること、4)Pyrimethamineがバベシア原虫の増殖抑制効果を示すこと、が明らかとなった。TgDHFR-Ts遺伝子を用いた遺伝子導入バベシア原虫の回収効率の向上に向けた研究は現在もなお進行中である。

这项研究的目的是建立一种创建遗传修饰的原生动物的方法，该方法可以通过将含有异源靶基因的表达盒引入原生动物体并将其掺入原生动物基因中来组成性地表达感兴趣的蛋白质。首先，构建了三种类型的转移矢量，包括带有真核细胞CAG启动子的增强的绿色荧光蛋白（EGFP）表达盒，来自Toxoplasma gondii的GRA1启动子或上游Babesia Bovis的RAP-1启动子，以及上游的Babesia Bovis，并通过电子产品将基因引入Babesia Bovis Worms。结果，我们观察到来自细胞质内的透明荧光颜色的正图像，只有在T. gondii中使用GRA1启动子引入的EGFP载体的Babesia原生动物。然而，这种阳性原生动物的发生率在约0.01％的情况下较低，并且在基因转移后的第四天完全消失了荧光图像，因此需要进一步改善（在Fujii等人，J。Protozool。Res。）。接下来，我们通过利用TGDHFR-TS基因（称为耐药性基因）选择转基因原生动物，并试图提高原生动物的恢复效率。首先，研究了对Babesia原生动物的乙胺碱的生长抑制作用，一种对TGDHFR-TS蛋白具有抗性的药物。结果表明，嘧啶氨酸可以用IC_ <50>，0.8-3.2μg/ml的原生动物的体外生长显着抑制（Nagai等，Antimocrob。Antentent。Chemother。，2003）。因此，目前正在研究一种能够共表达耐吡胺甲胺TGDHFR-TS基因和EGFP基因的新转移载体，目前正在研究eGFP基因表达的B. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. f.fp基因。从上述结果中可以看出，1）可以使用电穿孔将转移载体引入原生动物中，2）外国基因可以由T. gondii的Gra1启动子在原生动物中表达，3）外国基因可以在原生动物中表达，3）尽管瞬时，egfp egfp egfp的作用是在原生动物中表达的，并且在原生动物中表达了priben的作用。原生动物的原生动物生长。研究仍在进行研究，以提高使用TGDHFR-TS基因恢复转基因Babesia原生动物的效率。