ポリーN-アセチルラクトサミンの癌浸潤における役割

聚-N-乙酰乳糖胺在癌症侵袭中的作用

基本信息

批准号：
02F00661
负责人：
村松喬
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ポリーN-アセチルラクトサミン合成にかかわる酵素β1-6アセチルグルコサミンニルトランスフェラーゼ(IGnT A及びIGnT B)の発現を抑えるのために、IGnT遺伝子の翻訳開始部位をターゲットとするセンス及びアンチセンス(IGnT A : GACCCTTGAGCATGCCTCCGT ; IGnT B : TGCTTTGGGAAGATGGGCTCTTGG)配列をもったモルフォリノ誘導体を作成した。そして、Es細胞、EC細胞(F9及びP19)にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を用いて、酵素活性測定、RT-PCR法による遺伝子の発現解析及び^3H-フコースでメタボリックラベルした後、糖鎖の解析を行った。いずれの場合もセンス、アンチセンスで大きな変化は確認できなかった。そこでIGnT遺伝子ノックアウトマウスを作成するためにIGnT A、IGnT B共通のエクソン(エクソンIII)を欠失したコンスラクトを作成した。このコンスクラクトをES細胞にエレクトポーレイションでトランスフェクトし、G418で選択した。生き残ったES細胞156個をサザンブロット法で解析した結果、内在性IGnT遺伝子と相同組換えを起したES細胞は1個のみであった。この細胞を用いて、キメラマウスを作成した。IGnTノックアウトマウスを作成するために、キメラマウスを野生型C57BL/6Jと交配して、F1ヘテロマウスを得ることができた。F1のヘテロ同士を交配して、IGnT遺伝子ノックアウトマウス得ることができた。このマウスについてノーザンブロット及びサザンブロットで遣伝子のノックアウトを確認することできた.肝臓、腎臓、小腸、胃の組織抽出物を用いて、IGnTの活性を調べたところ、いずれも活性が野生型に比べて消失していた。現在ノックアウトマウス由来の繊維芽細胞の癌化細胞、さらに、ノックアウトマウス由来のES細胞を樹立し、これらの造腫瘍能をこれらにIGnTをトランスフェクトしたものと比較しょうと研究を続けている。

To suppress the expression of the enzymes β1-6 acetylglucosaminenyltransferase (IGnT A and IGnT B), which are involved in polyN-acetyllactosamine synthesis, morpholino derivatives containing the sense and antisense (IGnT A: GACCCTTGAGCATGCCTCCGT; IGnT B: TGCTTTGGGAAGATGGCTCTTG) sequences targeting制备了IGNT基因的翻译起始位点。然后转染ES细胞和EC细胞（F9和P19）。转染的细胞用于测量酶活性，通过RT-PCR分析基因表达，并用 ^3H-羟基糖的代谢标记，然后分析聚糖。无论哪种情况，均未在有意义的或反义中观察到重大变化。因此，为了创建IGNT基因基因敲除小鼠，我们创建了一种删除外显子（外显子III）和INGT B和INGTB的构建体。该混音被带有选择性的ES细胞并用G418选择。 156通过Southern印迹分析了存活的ES细胞，发现只有一个ES细胞与内源性IGNT基因同源重组。细胞用于生成嵌合小鼠。为了创建IGNT敲除小鼠，用野生型C57BL/6J饲养嵌合小鼠，以获得F1杂型小鼠。 F1异源小鼠能够配对以获得IGNT基因敲除小鼠。北部和南部印迹证实了老鼠的淘汰。当使用肝脏，肾脏，小肠和胃中的组织提取物检查IGNT活性时，与野生型相比，两者的活性都丢失了。目前，我们已经从基因敲除小鼠以及基因敲除小鼠的ES细胞建立了成纤维细胞的癌细胞，并正在继续我们的研究，以将这些肿瘤生成的潜力与用IGNT转染的潜力进行比较。