bach1/bach2二重ノックアウトマウスを用いたヘム応答性遺伝子制御システムの解析

使用bach1/bach2双敲除小鼠分析血红素反应基因调控系统

基本信息

批准号：
02F00526
负责人：
五十嵐和彦
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00526/
关键词：
bach1 bach2 クロマチンヘムヘムオキシゲナーゼグロビン

项目摘要

GST-Bach1融合蛋白質を大腸菌で発現・精製し,ウサギに注射し抗血清を計6種類得た。免疫沈降に使用可能な抗体をスクリーニングし,うち1つは内在性Bach1を免疫沈降できることを確認した。NIH3T3細胞を用いて,ヘミン処理前後のBach1-エンハンサー複合体の動態をクロマチン免疫沈降法で検討した。NIH3T3細胞では,HO-1の発現はごく低いが,細胞をヘミン(10μM)で処理することにより,2-3時間内にmRNA転写が強く誘導された。この時間経過で,HO-1エンハンサーへのBach1の結合量をクロマチン免疫沈降法で測定したところ,誘導前にはエンハンサーにBach1がMafKとの複合体として結合しているが,ヘミン処理後30分内にBach1がエンハンサーから解離することが明らかになった。この間,MafKはエンハンサーに結合したままであり,Bach1の解離とともに活性化サブユニットNrf2がエンハンサーに結合してくることも判明した。転写抑制や活性化に関わるクロマチン修飾を同様にクロマチン免疫沈降法で検討したところ,Bach1により転写が抑制されている状態でもクロマチンは活性化型の修飾(H3およびH4ヒストンのアセチル化やH3 K4のメチル化)を受けていた。Bach1はエンハンサーに結合し転写を抑制するが,この抑制は活性化の前段階に相当する状況にあること,すなわち,Bach1はエンハンサーやプロモーターにおける転写複合体を途中の段階に留め置くこと(poising)により転写を抑制すると考えられた。さらに,ヘムにBach1を標的としてその活性を変えることにより,エンハンサー上での転写抑制因子と活性化因子の動的変換を誘導することが理解された。すなわち,生命にとって必須の補欠分子ヘムが,核内では転写複合体の動態制御をも行うことが初めて明らかになった。

在大肠杆菌中表达纯化GST-Bach1融合蛋白，注射至家兔体内，共获得6种抗血清。我们筛选了可用于免疫沉淀的抗体，其中一种被证实能够免疫沉淀内源性 Bach1。使用 NIH3T3 细胞，我们通过染色质免疫沉淀研究了氯化血红素处理前后 Bach1 增强子复合物的动态。尽管 NIH3T3 细胞中 HO-1 的表达非常低，但用氯化血红素 (10 μM) 处理细胞后 2-3 小时内强烈诱导 mRNA 转录。在此期间，通过染色质免疫沉淀测定Bach1与HO-1增强子结合的量，发现诱导前Bach1与增强子以与MafK的复合物形式结合，但在氯高铁血红素处理后30分钟，Bach1结果表明，Bach1 在此期间与增强子结合成复合物。在此期间，MafK仍然与增强子结合，并且还发现激活亚基Nrf2随着Bach1的解离而与增强子结合。当我们使用染色质免疫沉淀类似地检查与转录抑制和激活相关的染色质修饰时，我们发现即使转录被 Bach1 抑制，染色质仍然会发生激活型修饰（H3 和 H4 组蛋白的乙酰化以及 H3 K4 甲基化）。 Bach1与增强子结合并抑制转录，但这种抑制处于与预激活阶段相对应的情况，即Bach1将增强子和启动子处的转录复合物保持在中间阶段（平衡）。经过此外，据了解，将 Bach1 靶向血红素并改变其活性会诱导增强子上转录抑制子和激活子的动态交换。换句话说，首次揭示了生命所必需的人工分子血红素也控制着细胞核内转录复合物的动态。