ES細胞を用いた細胞記憶の改変技術の開発

开发利用ES细胞的细胞记忆修饰技术

基本信息

批准号：
20659041
负责人：
五十嵐和彦
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659041/
关键词：
ES細胞クロマチン細胞記憶転写因子メチル化

项目摘要

メチオニン・アデノシル基転移酵素(MAT)は、S-アデノシルメチオニン(SAM)の生合成に必須の酵素である。合成されたSAMはメチル基転移酵素(MT)の基質として利用され、そのメチル基はDNA中のシトシンやヒストンのリジン残基などへ転移され、クロマチンレベルでの細胞記憶を支配する。本研究の主題は、MATに着目してヒストンやDNAのメチル化を包括的に低下させる方法を開拓し、細胞記憶を消去することによりクロマチンと細胞の可塑性を高める技術を開発することにある。まず、MATのアイソザイムの一つMATIIを様々な培養細胞でノックダウンを行い、ヘテロクロマチン構造やヒストンメチル化状態の変化を調べた。さらに、MATII結合因子をプロテオミクス技術を駆使して特定し、MATII以外の標的分子の探索を行った。肝臓細胞株、マクロファージ株で効率よくMATIIをノックダウンする条件を決めた。このノックダウン下ではヘテロクロマチン構造により抑制されている遺伝子発現が亢進すること、また、ヘテロクロマチン構造に重要なヒストンメチル化やユビキチン化が低下することを見いだした。同様の実験をES細胞で行うために、種々条件検討を行ったが、肝臓細胞株等と同等のノックダウン効率を達成することはできていない。現在、効率改善の検討、および、この不完全なノックダウン下でもヘテロクロマチン構造が変化する可能性を検討している。最終的には転写因子とMATIIノックダウンを組み合わせることによりES細胞分化能を変換させることを目指したが、ここまでは到達できなかった。しかし、その基盤技術開発には成功しており、今後も発展を目指したい。また、MATII結合因子の探索よりヘテロクロマチン化への関与が予想される新規因子を複数見いだしており、これらも細胞記憶改変の標的となる可能性があり、さらに研究を継続する。

甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）生物合成的必需酶。合成的 SAM 用作甲基转移酶 (MT) 的底物，其甲基基团转移到 DNA 中的胞嘧啶和组蛋白中的赖氨酸残基，在染色质水平上控制细胞记忆。本研究的课题是以MAT为重点，开发一种全面降低组蛋白和DNA甲基化的方法，并开发一种通过擦除细胞记忆来增强染色质和细胞可塑性的技术。首先，我们在各种培养细胞中敲低 MATII（MAT 同工酶之一），并检查异染色质结构和组蛋白甲基化状态的变化。此外，我们利用蛋白质组学技术鉴定了MATII结合因子，并寻找MATII以外的靶分子。我们确定了有效敲低肝细胞系和巨噬细胞系中 MATII 的条件。我们发现，在这种敲低下，受异染色质结构抑制的基因表达增强，而对异染色质结构重要的组蛋白甲基化和泛素化则减少。尽管研究了各种条件以使用 ES 细胞进行类似实验，但尚不可能达到与肝细胞系相当的敲低效率。我们目前正在研究提高效率的方法以及即使在这种不完全敲低的情况下异染色质结构也发生变化的可能性。最终，我们的目标是通过结合转录因子和MATII敲低来转化ES细胞的分化潜力，但我们未能达到这一点。不过，我们已经成功地开发了基础技术，并且我们希望在未来继续开发它。此外，通过寻找MATII结合因子，我们发现了多个有望参与异染色质化的新因子，这些也可能是细胞记忆修饰的靶点，因此我们将继续我们的研究。