ニューロン変性や細胞死の早期兆候を知る(lacZ-EM法)

了解神经元变性和细胞死亡的早期迹象（lacZ-EM 方法）

基本信息

批准号：
13878159
负责人：
杉本哲夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878159/
关键词：
lacZ β-ガラクトシダーゼノックアウトマウスニューロン変性

项目摘要

ニューロン死の機序を明らかにすることは脳病態を解明する上で意義が大きい。成熟脳において特定のニューロンの変性を来すノックアウトマウスに着目し、ニューロン死の早期兆候を知る方法の開発を企図した。ニューロン変性や細胞死は一定の週齢以降に誘発されるため、幼弱期において脳のlacZ発現細胞を電子顕微鏡下に観察した。発現しているlacZをβ-ガラクトシダーゼ組織化学法により高感度検出する方法を確立した。方法の特色を下に列記した。これまでのlacZ検出法は主にlacZが過剰発現している遺伝子変異マウスの細胞においてなされているが、本法はノックアウトマウスにおいてターゲット遺伝子をlacZカセットにより置換した例にも適用し得たため、より高感度で実用的な方法と考えられた。今回用いたlacZ-EM法の特色(概要):1.パラフォルムアルデヒド潅流固定(グルタールアルデヒドは検出感度低下を来すので省略した)。2.X-gal反応(Houtani et al.,J.Comp.Neurol.,424(3)489-508,2000による)。3.後固定(グルタールアルデヒドとオスミウムを使用)。4.脱水(プロピレンオキシドは検出感度低下を来すので省略した)。ノシセプチン受容体遺伝子欠損マウス(ホモ接合体)の視床下部腹内側核にて本法を適用したところ、細胞体に高電子密度の顆粒が局在しているニューロンを明瞭に識別することが可能であった。

阐明神经元死亡的机制对于阐明脑病理学具有重要意义。我们专注于导致成年大脑中特定神经元退化的基因敲除小鼠，旨在开发一种检测神经元死亡早期迹象的方法。由于在一定年龄后会诱发神经元变性和细胞死亡，因此在儿童早期在电子显微镜下观察到大脑中表达 lacZ 的细胞。我们建立了一种使用 β-半乳糖苷酶组织化学检测表达的 lacZ 的高灵敏度方法。该方法的特点如下所示。以前的lacZ检测方法主要是在过度表达lacZ的基因突变小鼠的细胞上进行的，但这种方法也可以应用于目标基因被lacZ盒取代的敲除小鼠，使得这种方法被认为更加有用。具有高度的敏感性和实用性。此次使用的lacZ-EM法的特点（概要）： 1.多聚甲醛灌注固定（戊二醛因降低检测灵敏度而省略）。 2.X-gal 反应（根据 Houtani 等人，J. Comp. Neurol., 424(3) 489-508, 2000）。 3.后固定（使用戊二醛和锇）。 4.脱水（环氧丙烷被省略，因为它降低了检测灵敏度）。当将该方法应用于伤害感受肽受体基因缺陷小鼠（纯合子）的腹内侧下丘脑核时，可以清楚地识别细胞体中存在电子致密颗粒的神经元。