ニューロン変性や細胞死の早期兆候を知る(lacZ-EM法)

了解神经元变性和细胞死亡的早期迹象（lacZ-EM 方法）

基本信息

批准号：
13878159
负责人：
杉本哲夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878159/
关键词：
lacZ β-ガラクトシダーゼノックアウトマウスニューロン変性

项目摘要

ニューロン死の機序を明らかにすることは脳病態を解明する上で意義が大きい。成熟脳において特定のニューロンの変性を来すノックアウトマウスに着目し、ニューロン死の早期兆候を知る方法の開発を企図した。ニューロン変性や細胞死は一定の週齢以降に誘発されるため、幼弱期において脳のlacZ発現細胞を電子顕微鏡下に観察した。発現しているlacZをβ-ガラクトシダーゼ組織化学法により高感度検出する方法を確立した。方法の特色を下に列記した。これまでのlacZ検出法は主にlacZが過剰発現している遺伝子変異マウスの細胞においてなされているが、本法はノックアウトマウスにおいてターゲット遺伝子をlacZカセットにより置換した例にも適用し得たため、より高感度で実用的な方法と考えられた。今回用いたlacZ-EM法の特色(概要):1.パラフォルムアルデヒド潅流固定(グルタールアルデヒドは検出感度低下を来すので省略した)。2.X-gal反応(Houtani et al.,J.Comp.Neurol.,424(3)489-508,2000による)。3.後固定(グルタールアルデヒドとオスミウムを使用)。4.脱水(プロピレンオキシドは検出感度低下を来すので省略した)。ノシセプチン受容体遺伝子欠損マウス(ホモ接合体)の視床下部腹内側核にて本法を適用したところ、細胞体に高電子密度の顆粒が局在しているニューロンを明瞭に識別することが可能であった。

确定神经元死亡的机制在阐明脑病理学中具有重要意义。为了关注导致成熟大脑中特定神经元变性的敲除小鼠，我们计划开发一种方法来识别神经元死亡的早期迹象。由于一周年龄的一周后会诱导神经元变性和细胞死亡，因此在早期阶段在电子显微镜下观察到表达LACZ的细胞。已经建立了一种通过β-半乳糖苷酶组织化学对表达的LACZ高度敏感的方法。该方法的特征如下列出。先前的LACZ检测方法主要用于过表达LACZ的突变小鼠的细胞，但是该方法也适用于靶基因被敲除小鼠中的LACZ盒代替的情况，因此被认为是一种更敏感和实用的方法。 LACZ-EM方法的特征这段时间（概述）：1。多聚甲醛灌注固定（戊二醛被省略了，因为它降低了检测敏感性）。 2。X-GAL反应（根据Houtani等人，J。Comp。Neurol。，424（3）489-508,2000）。 3。后缀（使用戊二醛和oSmium）。 4。脱水（我省略了氧化丙烷，因为它降低了检测敏感性）。当将此方法应用于缺乏伤害性受体基因（纯合子）的小鼠下丘脑的腹侧核时，细胞体中局部的高电子密度颗粒的神经元显然能够区分。