C型肝炎ウイルスゲノムにコードされる新規蛋白質の探索

寻找丙型肝炎病毒基因组中编码的新蛋白质

基本信息

批准号：
13877045
负责人：
加藤宣之
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13877045/
关键词：
C型肝炎ウイルスコア蛋白質遺伝子増幅フレームシフト

项目摘要

本研究ではHCVゲノムのコア蛋白質をコードする領域に存在するORF2は既報のウイルス株間で良く保存されていることから、このORF2から実際に蛋白質レベルまで発現しているかどうかを明らかにすることを目的として、HCV陽性の肝がん組織に存在する多数のHCVゲノムのコア蛋白質をコードする領域について構造解析を行い、以下に示すような結果を得た。HCVゲノムをRT-PCRにより増幅の際、塩基の欠損や読み間違いが高頻度に起こると結果の解釈を誤ることになるので、本研究では、高い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性(Proofreading活性)を有する耐熱性のKOD-plus DNAポリメラーゼを用いて、HCVゲノムのコア蛋白質をコードする領域を増幅した。4例の肝癌患者由来の癌部および非癌部を対象として用いて、それぞれの増幅産物から独立的に得た200クローン以上の遺伝子解析を行った。その結果、Proofreading活性のないTaq DNAポリメラーゼを用いた従来の解析によりこれまでに報告されていたような結果とは異なり、ヌクレオチドの欠損や終止コドンの出現はまったく認められず、癌部と非癌部におけるHCVの準種(quasispecies)の状態にも差がみられないことが判った。しかし、ORF2が翻訳されると当初予想していたような開始コドン下流における1塩基の欠失はまったく認められなかったことから、ORF2が直接的に翻訳されるようなゲノム構造を有するHCVは存在していないか、或いは存在していても非常に低頻度であると考えられた。しかしながら、このような遺伝子解析の過程において、9番目のコドンがAGA(Arg)からAAA(Lys)に置換しているクローンが6個得られた。この転移型置換により、これら6個のクローンではコドン8〜11においてA8〜10個のユニークなAストレッチ構造となっていた。最近、別のグループによりこのようなAストレッチ構造が-2/+1のリボゾームフレイムシフトを引き起こして、ORF2が翻訳される(F蛋白質)ことが明らかにされていることから、我々が得たクローンについてもリボゾームフレイムシフトによりF蛋白質が産生されることが示唆された。162アミノ酸から成るF蛋白質のなかで、HCV株間で比較的保存されていて、B細胞エピトープになると期待されたペプチド配列(18アミノ酸)に対する抗体をウサギにて作成することができたため、現在、Aストレッチ構造を有するクローンを培養細胞に導入してF蛋白質の検出をWestern blot法により試みている。

在这项研究中，编码HCV基因组核心蛋白的区域中存在的ORF2在先前报道的病毒菌株中是充分保守的，因此我们对编码HCV阳性肝癌组织中众多HCV基因组的核心蛋白的区域进行了结构分析，并获得了如下所示的结果。当通过RT-PCR扩增HCV基因组时，如果经常发生碱性缺陷或误读，则结果将被误解。在这项研究中，使用具有高3' - > 5'核酸酶活性（校对活性）的热耐热的KOD-Plus DNA聚合酶（校对活性）来扩增编码HCV基因组的核心蛋白的区域。使用从四个肝癌患者衍生的癌性和非癌性区域进行了独立于扩增产物获得的200多个克隆的遗传分析。结果表明，与使用TAQ DNA聚合酶进行的常规分析报告不同，没有校对活性，没有观察到终止密码子的核苷酸缺陷或出现，并且在癌症和非癌性区域中HCV准蛋白酶的状态没有差异。但是，由于没有观察到启动密码子下游的单个碱基删除，因此最初预期要翻译ORF2，因此人们认为没有HCV具有直接翻译ORF2的基因组结构，或者很少经常翻译。但是，在此遗传分析中，获得了六个克隆，其中第九个密码子被AAA（LYS）代替了AGA（ARG）。在这六个克隆中，这种易位类型的替代在密码子8-11处产生了唯一的A伸展结构。最近，另一组揭示了这种拉伸结构引起-2/+1的核糖体火焰移位，从而导致ORF2（F蛋白）的翻译，这表明我们获得的克隆中的核糖体火焰转移也会产生F蛋白。在162个氨基酸F蛋白中，针对肽序列（18个氨基酸）的抗体在HCV菌株中相对保守并有望成为B细胞表位，可以在兔子中生产B细胞表位，因此我们目前正在使用蛋白质的F蛋白使用蛋白质的蛋白质引入A stratch结构，以使用蛋白质布料进行培养的细胞。