C型肝炎ウィルスの増殖により発現制御されるがん化要因遺伝子の探索

寻找其表达受丙型肝炎病毒增殖调节的致癌基因

基本信息

批准号：
08264244
负责人：
加藤宣之
金额：
$ 2.88万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08264244/
关键词：
C型肝炎ウィルス HCV増殖系 HCV感染細胞 HCV分子種マイナス鎖RNA Diffeerential display

项目摘要

本研究ではC型肝炎ウイルスの感染により細胞がどのような変化を受け、がん化の方向に誘導されるかを調べることを目的として培養細胞を用いたHCVの持続感染系の開発を行ない、感染細胞内におけるHCVの量的及び質的解析を行なった。同時に、HCV感染により細胞が受ける影響についても解析した。(1)培養細胞を用いたHCV増殖系のCharacterization PCR法を用いたHCV RNAの半定量的解析を開発し、HCVに感受性を示すヒトリンパ球由来のMT-2C細胞内においてHCV RNAが経時的に増加することを明らかにした。また、細胞内におけるHCVの複製中間体と考えられるマイナス鎖RNAを鎖特異的方法を用いて検出することができた。(2)ヒト肝細胞由来の細胞株を用いたHCV増殖系の開発ヒト肝の非がん部由来でSV40ラージT抗原の導入により不死化したPH5CH細胞を用いたHCVの増殖系の開発に成功した。さらに細胞をクローン化することによりHCVの複製効率の良い3種類の細胞株を得た。(3)HCVの長期培養システムの確立感染後の培養温度を37°Cから32°Cに低下させることによりHCVを長期間培養維持できることを見い出した。32°Cでの培養では最大6.5カ月HCVを維持でき、HCVのcell-freetransmissionの効率も37°Cに較べて良いことが分かった。HCVの複製増殖を制御する因子として増殖因子やサイトカインを想定して各種因子の量を測定したところ、TNF-αのみが32°Cで著しく低下していることが分かった。(4)HCV感染細胞におけるHCV分子種の解析 HCV感染後12日目の細胞におけるHCV分子種を調べた結果、感染に使われた血清中に認められた多くのHCV分子種のうち、ある限られた分子種に収束していることが判明した。従って、細胞に対するHCVのadaptationが示唆された。(5)HCV増殖により発現異常を示す細胞遺伝子の探索HCV感染後1週間以上経過したMT-2C細胞、PH5CH細胞及び未感染細胞由来の総RNAを用いて、RT-PCRをベースにしたdifferential displayを行なった。その結果、HCV感染細胞由来のRNAにのみ検出されるPCR産物がいくつか得られ、現在、それらについて解析中である。

在这项研究中，我们开发了使用培养细胞连续HCV感染的连续HCV感染系统，目的是研究由丙型肝炎病毒感染引起的细胞变化，并对感染细胞中HCV进行了定量和定性分析。同时，还分析了HCV感染对细胞的影响。（1）我们使用培养细胞的HCV生长系统的表征对HCV RNA进行了半定量分析，并揭示了HCV RNA在MT-2C细胞中随着时间的推移而增加的MT-2C细胞增加，这些细胞源自对HCV敏感的人类淋巴细胞。此外，可以使用链特异性方法检测到负链RNA，被认为是细胞中HCV复制的中间体。（2）使用源自人肝细胞的细胞系开发HCV增殖系统，我们使用源自人肝脏的非癌症区域得出的PH5CH细胞成功地开发了HCV增殖系统，并通过引入SV40大型T抗原。此外，将细胞克隆以获得三种类型的细胞系，具有高复制效率的HCV。（3）建立了HCV的长期培养系统，我们发现可以通过降低37°C到32°C后的培养温度来长时间保持HCV。在32°C下进行培养可以使HCV保持长达6.5个月的状态，发现HCV的无细胞传输效率优于37°C。当测量各种因子的量时，假设生长因子和细胞因子是调节HCV复制增长的因素，发现在32°C时只有TNF-α显着降低。（4）在HCV感染后的第12天检查细胞中HCV感染细胞中HCV分子物种的分析，发现在用于感染的血清中发现的许多HCV分子物种中，发现该物种会融合到有限的分子数量中。因此提出了对细胞的HCV适应。（5）使用基于RT-PCR的差异显示，使用MT-2C细胞，PH5CH细胞和未感染的细胞，使用基于RT-PCR的差异显示来搜索显示出HCV增殖差异显示异常的细胞基因，这些差异显示在HCV感染后一周以上已感染了一周以上。结果，已经获得了只能在HCV感染细胞的RNA中检测到的几种PCR产物，目前正在进行分析。