C型肝炎ウイルス感染による肝線維化の分子生物学的解析

丙型肝炎病毒感染引起的肝纤维化的分子生物学分析

基本信息

批准号：
16659120
负责人：
加藤宣之
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は昨年度に樹立した遺伝子型1bのHCV-O株由来の全長HCV RNA複製細胞(O細胞)をインターフェロンで処理することによりHCV RNAを排除した治癒細胞(Oc細胞)を樹立した。Oc細胞はHCV RNAを含まず、O細胞と細胞のバックグラウンドが同じため、HCV RNA複製の有無による宿主細胞の線維化関連因子への影響を検討できる良い材料である。さらに、線維化に関連している宿主遺伝子としてCTGF (Connective Tissue Growth Factor)に着目し、CTGFのプロモーター領域をクローニングした。CTGFのプロモーター領域を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだプラスミドを作成し、レポーターアッセイ系を構築した。CTGFはTGF-βにより産生され、肝線維化の原因となるcollagenを産生する。また、O細胞およびOc細胞でのTGF-βの産生についてreal time PCRでの定量を、現在試みている。また、肝線維化はアルコール、鉄などにより促進されるためこれらによる刺激を加えた時に産生されるTGF-βの定量も行っている。今後の計画として、ヒト肝癌細胞株HuH-7由来のO細胞およびOc細胞をヒトstellate細胞と共培養することで、1)構築したCTGFプロモーターのアッセイ系を用いたstellate細胞におけるCTGF発現の検討、2)線維化の最終産物であるcollagenのstellate細胞での発現の検討を予定している。さらに、アルコール、鉄刺激によりこれらの宿主因子のstellate細胞での発現量を検討したい。本年度は全長HCV RNAを複製するヒト肝細胞(O細胞)とstellate細胞との共培養系を構築することができた。今後この共培養系を用いてHCVの肝線維化に及ぼす分子生物学的機構を解明し、さらに肝線維化を抑制する薬剤への応用へと研究を発展させていきたい。

今年，我们建立了通过处理源自去年与Interferon建立的基因型1b的HCV-O菌株（源自基因型1b的HCV-O菌株）来排除HCV RNA的治疗细胞（OC细胞）。 OC细胞不含HCV RNA，并且在O细胞和细胞之间具有相同的背景，使其成为可以检查HCV RNA复制对宿主细胞纤维化相关因子的影响或不存在的材料。此外，我们专注于CTGF（结缔组织生长因子）作为与纤维化相关的宿主基因，并克隆了CTGF的启动子区域。创建了一个质粒，其中将CTGF的启动子区域纳入了荧光素酶基因的上游，并构建了记者测定系统。 CTGF由TGF-β产生并产生胶原蛋白，从而导致肝纤维化。我们目前还试图通过实时PCR来量化O和OC细胞中的TGF-β。此外，肝纤维化是通过酒精，铁等促进的，因此TGF-β的定量也是在使用这些结果施加刺激时产生的。作为未来的计划，我们计划使用人肝癌细胞系HUH-7与人类星状细胞共培养O和OC细胞，1）使用用于构建的CTGF启动子的测定系统检查星状细胞中的CTGF表达，以及2）检查胶原蛋白的表达，胶原蛋白的最终产物，是固化细胞的最终产物。此外，我们想通过刺激酒精和铁来研究这些宿主因子在星状细胞中的表达水平。今年，我们能够构建复制全长HCV RNA的人类肝细胞（O细胞）和星状细胞的共培养系统。将来，我们将使用该共培养系统来阐明影响HCV肝纤维化的分子生物学机制，并进一步发展对抑制肝纤维化的药物应用的研究。