C型肝炎ウイルス蛋白質の転写調節能とゲノム不安定化能に関する研究

丙型肝炎病毒蛋白转录调控能力及基因组去稳定能力研究

基本信息

批准号：
13214068
负责人：
加藤宣之
金额：
$ 3.46万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

HCV蛋白質の細胞機能に及ぼす影響とがん化との関係を明らかにすることを目的として、HCV蛋白質が肝細胞における転写調節能やDNA修復能にどのような影響を及ぼすかを調べた。HCV蛋白質の転写調節能に関しては、昨年度までに、interferonにより誘導される2'-5'-OAS遺伝子promoterのHCVコア蛋白質による活性化(5,6倍)がpromoter領域に1 copy存在するISREを介していることが示唆されていたことから、その可能性について追究した。ISREのconsensus配列だけをtandemに5回繰り返した配列に対しては、コア蛋白質は2倍程度の活性化能を示したが、ISREのconsensns配列を1 copy有する代表的なPKR遺伝子promoterに対してはコア蛋白質はほとんど活性化能を示さないことを明らかにした。これらの実験結果と2'-5'-OAS遺伝子promoterに存在するISREがconsensns配列と少し異なるという事実から、コア蛋白質はISREを持つ遺伝子の一部を選択的に活性化することが示唆された。2'-5'-OAS遺伝子の活性化に関するコア蛋白質の責任領域については、これまでに作成したコア蛋白質の内部の一部を欠損させた変異体では、いずれもある程度の活性化能が残存していたことから、今年度はアミノ酸配列がよく保存されているアミノ末端部に着目して検討した。その結果、アミノ末端部20アミノ酸を欠くだけで、活性化能が完全に消失することを明らかにした。EGFPとの融合蛋白質として発現させて細胞内局在を調べたところ、アミノ末端部の欠失体も本来のコア蛋白質と同様に核膜近縁に局在していたことから、アミノ末端部20アミノ酸に関わる何らかの因子がこの活性化能に関与していることが示唆された。HCV蛋白質のDNA修復系への影響に関しては、昨年度までに開発した培養細胞レベルでのミスマッチ修復能に関するアッセイ系を用いて細胞内で発現させたHCV蛋白質のマイクロサテライト不安定化能を測定した。レトロウイルスベクターにより各種HCV蛋白質を恒常的に発現させたヒト不死化肝細胞を用いてマイクロサテライト不安定性に関するアッセイを行った。その結果、コア蛋白質(遺伝子型1b)を発現している細胞においてのみE1,E2或いはNS5A蛋白質を発現している細胞やMock infectionを行った細胞と比較して導入したマイクロサテライトは2-3倍の頻度で不安定化していることを明らかにした。遺伝子型の異なるコア蛋白質についても同様に検討した結果、1b型(最も顕著)と2a型のコア蛋白質の場合にのみマイクロサテライトの不安定化能が認められたが、1a型、2b型、3a型のコア蛋白質にはそのような効果がないことを明らかにした。このような遺伝子型による違いは、肝がん患者に1b型や2a型が多いという背景と一致しており、今後さらに詳しく調べる必要がある。

为了阐明HCV蛋白对细胞功能和癌症发育的影响之间的关系，我们研究了HCV蛋白如何对肝细胞中转录调控和DNA修复能力的影响。关于HCV蛋白的转录调节能力，我们研究了HCV核心蛋白的干扰素诱导的干扰素诱导的激活（5,6倍）的转录调节能力是由ISRE介导的，这是启动子区域的副本。据透露，对于仅在串联中重复五次ISRE共识序列的序列，核心蛋白的激活能力大约是两倍，但是对于典型的PKR基因启动子具有ISRE共有序列的一个副本，核心蛋白的激活能力很少。这些实验结果以及2'-5'-OAS基因启动子中存在的ISRE与共识序列略有不同，这表明核心蛋白选择性地激活了携带ISRE的一些基因。关于负责2'-5'-OAS基因激活的区域，到目前为止创建的核心蛋白有缺陷的所有突变体都具有一定程度的激活能力，因此今年我们专注于氨基酸序列保守的氨基末端。结果，发现在氨基末端缺少20个氨基酸完全消除了激活能力。当将氨基末端缺失表示为具有EGFP的融合蛋白并检查其亚细胞定位时，建议与原始核心蛋白一样，与氨基末端的20个氨基酸相关的某些因子参与了这种激活能力。关于HCV蛋白对DNA修复系统的影响，使用在延长去年开发的培养细胞水平上的不匹配修复能力的测定系统测量了在细胞中表达的HCV蛋白的微卫星卫星稳定的能力。微卫星不稳定性测定是使用人生的肝细胞进行的，这些肝细胞用逆转录病毒载体组成型表达了各种HCV蛋白。结果，发现只有表达核心蛋白（基因型1B）的细胞比表达E1，E2或NS5A蛋白和受模拟感染的细胞的细胞稳定2-3倍。还考虑了具有不同基因型的核心蛋白质的类似研究，尽管仅在1B（最突出）和2A核心蛋白的情况下观察到微卫星不稳定能力，但揭示了对1A，2B和3A的核心蛋白没有这种影响。基因型上的这些差异与越来越多的肝癌患有1B型和2A的背景是一致的，将来需要进一步研究。