パッチクランプ法による細菌細胞のイオントランスポーターの解析

膜片钳法分析细菌细胞中的离子转运蛋白

基本信息

批准号：
13780536
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

平成13年度末に東京大学分子細胞生物学研究所より譲り受けたパッチクランプシステムの再構築を行った。機器の老朽化などの理由により、すぐには使用できなかったが、修理を重ねた結果、システムとして稼動することができた。平成13年度に検討を行った宿主大腸菌の巨大化条件を用い、大腸菌Na^+-セリン共輸送系であるSstTの輸送活性をパッチクランプ法により測定した。さまざまな条件検討を重ねたが、現在までのところ、有意な輸送活性を捉えることはできていない。この原因として、SstTの発現量がまだ不足している、用いている大腸菌の細胞膜が特に脆弱である、などの理由が挙げられる。一方では大量発現したSstTの精製方法を確立し、幾つかの性質について調べた(Kim,2002)。上記SstTと共に、大腸菌多剤排出ポンプAcrABの活性をパッチクランプ法によって測定した。SstTで有意な活性が得られていない理由の一つは発現量が少ないことであるが、AcrABの場合、特別な大量発現プラスミドを構築しなくとも十分量のタンパク質が発現している。こちらも活性は捉えられていないが、条件検討を重ねれば活性を捉えることができると考えられる結果を得ている。一方で、いくつかの細菌から新規多剤排出ポンプの遺伝子クローニングを行った。腸内連鎖球菌、セラチア、緑膿菌、セパシアなどから得られたものについてその性質を解析した(Cheng2003,Lee2003)。

2001年底，我们重建了从东京大学分子细胞生物学研究所收到的膜片钳系统。由于设备老化，无法立即使用，但经过反复维修，系统才得以投入运行。使用 2001 年研究的宿主大肠杆菌生长条件，通过膜片钳方法测量了 SstT（大肠杆菌 Na^+-丝氨酸共转运系统）的转运活性。尽管已经对各种条件进行了调查，但迄今为止尚未发现明显的运输活动。其原因包括SstT的表达水平仍然不足以及所使用的大肠杆菌的细胞膜特别脆弱。另一方面，我们建立了一种纯化大量表达的 SstT 的方法，并研究了它的一些特性（Kim，2002）。与上述SstT一起，通过膜片钳方法测量大肠杆菌多药外排泵AcrAB的活性。 SstT 没有获得显着活性的原因之一是表达水平较低，但就 AcrAB 而言，无需构建特殊的大规模表达质粒即可表达足够量的蛋白质。在这种情况下也没有检测到活动，但我们获得的结果表明，如果反复检查条件，可以检测到活动。另一方面，我们从几种细菌中克隆了新型多药外排泵的基因。对从肠球菌、沙雷氏菌、铜绿假单胞菌、洋葱杆菌等获得的细菌的特性进行了分析（Cheng 2003，Lee 2003）。