植物の環境ストレス耐性に関わる金属イオントランスポーターの構造基盤

参与植物环境胁迫耐受的金属离子转运蛋白的结构基础

• 批准号: 19K06526
• 负责人: 田中 良樹
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06526/
• 关键词: 結晶構造解析; 膜タンパク質; クライオ電子顕微鏡; 構造生物学; 輸送体タンパク質

初年度の時点で，サンプルの大量発現および精製方法の確立と結晶化スクリーニングを試みていたが、構造解析に必要な結晶化には成功していなかった。タンパク質構造を安定化させるため、抗体との共結晶化を行うことにした。抗体作製時に脂質と混合し、リポソーム再構成をすることでより構造を維持した抗原から構造認識抗体を得られるような工夫を施した。マウス腹水から結合可能性のある抗体候補を複数得ることができた。複数の抗体が得られたため、その中からサンプルと安定した強い結合を示す抗体を選択するため、それぞれをFab化後、サンプルと混合してゲル濾過することで単一の結合サンプルピークが得られるものの選別を行った。小スケールでの結合確認の結果、目的サンプルと十分な結合を示すFab化抗体が複数作製できたことを確認した。結合が確認できた抗体についてスケールを上げて、結晶化を行った。脂質キュービック法やバイセル法などの膜タンパク質輸送体に適した結晶化法を使用して結晶化を試み、微小結晶を得ることに成功し、回折実験に供した。いくつかの結晶化条件で予備的な低分解能データを得たが、分子置換可能なレベルのデータではなかった。それぞれ結晶化条件のリファインを行ったものの、分解能を向上するには至らず、立体構造の決定はできなかった。本研究期間中に全てのFab化抗体との組み合わせでの結晶化を実施できていないため、引き続き組み合わせを変え結晶化を行っていく必要があると考えている。

在第一年，我们试图建立一种用于大量样品表达和纯化的方法，以及结晶的筛选，但是结构分析所需的结晶并不成功。为了稳定蛋白质结构，确定了与抗体的共结晶。制备抗体时，将抗体与脂质混合并重构脂质体，从保留其结构的抗原中获得结构识别的抗体。可以从小鼠腹水获得的多种可能结合的潜在抗体候选物。由于获得了多种抗体，因此选择了它们与样品中的样品稳定且结合强的抗体，在它们中，它们中的每一种抗体都与样品混合并滤除了凝胶，以获得单一结合的样品峰。由于在小规模上确认结合，因此证实了多种与目标样品表现出足够结合的织物抗体。确认结合的抗体被缩放并结晶。使用适合膜蛋白转运蛋白（例如脂质立方和二烷）方法的结晶方法尝试结晶，并成功获得了微晶体，并进行了衍射实验。在几个结晶条件下获得了初步的低分辨率数据，但在分子替代水平下却没有获得。尽管结晶条件得到了完善，但不能改善分辨率，并且无法确定三维结构。由于在此研究期间不可能与所有FAB形成的抗体结合结晶，因此我们认为有必要继续改变组合和结晶。