パッチクランプ法による細菌細胞のイオン輸送系の包括的解析

利用膜片钳法综合分析细菌细胞离子传输系统

基本信息

批准号：
16013233
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 3.78万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16013233/
关键词：
パッチクランプ法多剤排出ポンプイオン輸送系

项目摘要

1.多剤排出ポンプの大量発現プラスミドの作成と大量発現及び活性測定アラビノースプロモーターを用いた大量発現系を構築できた。通常細胞では問題なく発現させることができるが、巨大プロトプラストでは、発現させると細胞膜の脆弱さがさらに進む、あるいはパッチクランプ法に適用できるほど巨大化できない、など不具合が生じた。条件検討をさらに重ね、ようやく活性測定できる態勢は整えることはできたが、活性を捉えるにはいたっていない。またリポソームへの再構成後、そのリポソームを巨大化させるという別の観点からのアプローチも急遽進めている。2.新規多剤排出ポンプ遺伝子のクローニング肺炎桿菌、腸炎ビブリオ、non-01コレラ菌、緑膿菌、セラチア、黄色ブドウ球菌から、機能相補の面及び一次構造の類似性の面から多剤排出ポンプ遺伝子をクローニングした。合計30種程度の新規多剤排出ポンプについて現在解析を行っており、そのうち半数以上がすでに解析を終了している(投稿準備中)。またNa^+/H^+アンチポーターについても解析を行った(Kuroda(2004))。3.大腸菌巨大プロトプラストにおける遺伝子発現プロファイルの解析パッチクランプ法による解析をさらに行いやすくするために、大腸菌巨大プロトプラストにおける遺伝子発現プロファイルを解析した。現在詳細なデータ解析を行っており、その結果を基に巨大化法の改善策などを決定する。4.黄色ブドウ球菌の巨大化及びパッチクランプ法による活性測定グラム陰性菌である大腸菌だけでなく、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌で巨大化の方法を新たに見出した。そして呼吸鎖、F-type ATPaseの活性をパッチクランプ法で捉えることに成功した(投稿準備中)。さらに細菌細胞よりも解析が進んでいる酵母についてパッチクランプ法による解析を行った(Kuroda(2004))。

1.用于大规模表达多药物外排泵的质粒的创建、大规模表达和活性测量我们能够使用阿拉伯糖启动子构建大规模表达系统。虽然它可以在正常细胞中毫无问题地表达，但巨型原生质体存在问题，例如细胞膜变得更加脆弱或细胞无法生长到足够大以应用于膜片钳方法。经过进一步考虑条件后，我们终于能够建立一个系统来测量活动，但我们还无法捕获活动。我们还从不同的角度快速推进一种方法：重构为脂质体，然后使脂质体变得更大。 2.新型多药外排泵基因的克隆来自肺炎克雷伯菌、副溶血性弧菌、non-01霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的多药外排泵基因已在功能互补性和一级结构相似性方面得到鉴定。克隆的。我们目前正在分析总共约30种新型多药外排泵，其中一半以上已经进行了分析（目前正在准备提交）。我们还分析了Na^+/H^+反向转运蛋白（Kuroda (2004)）。 3.大肠杆菌巨型原生质体中的基因表达谱分析为了便于膜片钳方法的分析，我们分析了大肠杆菌巨型原生质体中的基因表达谱。我们目前正在进行详细的数据分析，根据结果，我们将决定对系统放大方法进行改进。 4. 使用膜片钳法扩增金黄色葡萄球菌并测量活性我们发现了一种不仅可以扩增革兰氏阴性菌大肠杆菌，而且还可以扩增革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的新方法。我们还利用膜片钳方法成功捕获了呼吸链中F型ATP酶的活性（准备提交）。此外，我们对酵母进行了膜片钳分析，这比细菌细胞更容易理解（Kuroda (2004)）。