パッチクランプ法による細菌細胞のイオン輸送ネットワークの解析

膜片钳法分析细菌细胞内的离子传输网络

基本信息

批准号：
15013239
负责人：
黒田照夫
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1、パッチクランプ法による活性測定(モデル系の確立)モデル系として選択した大腸菌Na^+-セリン共輸送系SstTについては、発現量がうまく制御できず、有意な活性は得られなかった。大腸菌多剤排出ポンプAcrAB-TolCは巨大プロトプラストにおいてもその活性に外膜成分が必須であることが示唆され、こちらも活性測定できなかった。現在、2でその準備が整いつつある大腸菌多剤排出ポンプMdfAについて系を確立する予定である。2、大量発現プラスミドの構築上記MdfAと黄色ブドウ球菌多剤排出ポンプNorAについて大量発現プラスミドを構築した。その最滴な発現条件を検討した。この中でもMdfAについてが最も進んでいるが、発現量を大幅に上昇させると、巨大プロトプラストの大きさが小さくなってしまい、パッチクランプ法を適用するには難しいという状況になっている。今後、いくつかの条件を検討し、発現量が十分かつ巨大プロトプラストの大きさも十分であるという条件を見出していく。3、機能未知膜タンパク質の遺伝子クローニング多剤排出ポンプについては今年度、計13個の新規遺伝子をさまざまな細菌の染色体DNAからクローニングし、その解析を進めた。特筆すべきはこのうち、実に5種類がABC familyに属するものであるということである。現在まで細菌細胞の多剤排出ポンプのうち、ABC familyに属するものは3種類しか報告されておらず、細菌細胞にはあまりこのfamilyに属するものは存在しないのではないかとも考えられていた。しかし本研究により、今までクローニングをすることが困難であったために見つかっていないだけで、実際に少ないわけではないことが予想された。また大腸菌で発現させても活性が無いものなどもいくつか存在し、それらについても今回いくつかその性質を解析した。この中のいくつかについては、解析の結果、興味深い性質を有しているので、上記2を経てパッチクランプ法による測定を行うことを計画している。一方、多剤排出ポンプ以外についてもイオン輸送ネットワークにおいて重要な役割を担っているNa^+/H^+アンチポーターのクローニングを行い、その性質についても解析した。

1.膜片钳法活性测定(模型系统的建立) 对于选择作为模型系统的大肠杆菌Na^+-丝氨酸共转运系统SstT，表达水平不能很好地控制，没有获得显着的活性。有人认为，即使在巨大的原生质体中，大肠杆菌多药外排泵 AcrAB-TolC 的外膜成分对其活性也至关重要，但这里也无法测量该活性。我们目前正在计划建立大肠杆菌多药外排泵MdfA的系统，该系统正在2号准备。 2.大规模表达质粒的构建针对上述MdfA和金黄色葡萄球菌多药外排泵NorA构建大规模表达质粒。我们研究了最合适的表达条件。其中，MdfA取得了最大的进展，但如果表达水平显着提高，巨型原生质体的尺寸就会变小，使得膜片钳方法难以应用。未来我们会考察几个条件，找到表达水平足够、巨型原生质体大小也足够的条件。 3.功能未知的膜蛋白的基因克隆关于多药外排泵，今年我们从多种细菌的染色体DNA中克隆了总共13个新基因并进行了分析。值得注意的是，其中有五种类型属于 ABC 家族。迄今为止，仅报道了属于ABC家族的细菌细胞中的三种类型的多药外排泵，并且人们认为细菌细胞中该家族的成员可能并不多。然而，这项研究表明，这只是因为克隆技术一直很困难，直到现在才被发现，但这并不意味着它们的数量实际上更少。此外，还有一些化合物即使在大肠杆菌中表达也没有活性，这次我们分析了其中一些化合物的性质。分析结果显示，其中一些具有有趣的特性，因此我们计划在完成上述步骤 2 后使用膜片钳方法进行测量。另一方面，除了多药外排泵外，我们还克隆了在离子转运网络中发挥重要作用的Na^+/H^+反向转运蛋白，并分析了其性质。