新規三日熱マラリア伝搬阻止ワクチン候補抗原の同定

鉴定一种新型疫苗候选抗原以阻止间日疟原虫疟疾的传播

• 批准号: 13226087
• 负责人: 坪井 敬文
• 金额: --
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226087/
• 关键词: 三日熱マラリア; 伝搬阻止ワクチン; 生殖母体; 遺伝子クローニング; 国際研究者交流; タイ

新たな三日熱マラリア伝搬阻止ワクチン抗原を同定するため、本年度は生殖母体表面蛋白の遺伝子クローニングを行った。熱帯熱マラリア原虫生殖母体表面蛋白であるPfs48のアミノ酸配列を用いて三日熱マラリア原虫ゲノムシーケンスデータベースをBLAST検索した。その結果、アミノ酸配列でPfs48と比較的相同性の高い2つの短いDNA断片が得られた。この情報を基に、三日熱マラリア原虫実験室内株からPCRによりpvs48遺伝子の全長を増幅した。またpvs48の近傍を探索した結果、熱帯熱マラリア原虫で報告されたのと同様pvs48の約3kb上流にpvs47と思われる遺伝子が見出された。タイ国内のマラリア流行地において三日熱マラリア患者の同意を得た後採血し、分離精製した生殖母体からRNAを抽出した。また、同一患者血液から赤内型原虫を分離した後in vitro培養したオーキネートを作成し、それぞれからもRNAを抽出した。それらを用いてRT-PCRを行いpvs47の転写を確認した。その結果、Pvs47は生殖母体のステージにのみ転写されており、早期の有性生殖ステージ原虫に特異的と考えられた。またこのcDNAをクローン化した後塩基配列を解析した結果、pvs47の遺伝子はイントロンを含んでいないことが判明した。Pvs47の塩基配列から予想される433残基のアミノ酸配列の特徴としては、N末端にシグナル配列を持ち、C末端にはGPIアンカーと思われる短い疎水性領域が存在していた。またそれらの間には、システインに富む領域が存在し、Pfs47との構造比較から6個の保存的なシステインが存在する「6-Cys Domain」、2個の保存的なシステインが存在する「2-Cys Domain」、6個の保存的なシステインが存在する「6-Cys Domain」で構成されていた。これらの構造は、マラリア原虫に特異的な構造であった。

为了鉴定抑制间日疟原虫传播的新疫苗抗原，今年我们进行了配子体表面蛋白的基因克隆。使用恶性疟原虫配子体表面蛋白 Pfs48 的氨基酸序列对间日疟原虫基因组序列数据库进行 BLAST 搜索。结果，获得了两条与Pfs48氨基酸序列同源性较高的短DNA片段。基于这些信息，我们通过 PCR 扩增了实验室间日疟原虫菌株的 pvs48 基因的全长。此外，对pvs48附近进行搜索的结果是，在pvs48上游约3kb处发现了被认为是pvs47的基因，这与恶性疟原虫中报道的类似。征得泰国疟疾流行区间日疟患者同意后，采集血液，并从分离纯化的配子体中提取RNA。另外，从同一患者的血液中分离出赤内原生动物，并进行体外培养，并提取RNA。使用这些，进行RT-PCR以确认pvs47的转录。因此，Pvs47 仅在配子体阶段转录，并被认为是寄生虫早期有性生殖阶段特有的。此外，在克隆该cDNA并分析其碱基序列后，发现pvs47基因不包含内含子。从Pvs47的碱基序列预测的433个残基氨基酸序列在N末端具有信号序列，在C末端具有似乎是GPI锚定的短疏水区域。另外，它们之间存在富含半胱氨酸的区域，与Pfs47的结构比较显示，“6-Cys结构域”有6个保守的半胱氨酸，“2-Cys结构域”有2个保守的半胱氨酸-Cys结构域。 “6-Cys 结构域”，其中存在六个保守半胱氨酸。这些结构是疟疾寄生虫所特有的。