アポトーシス核変化制御因子p74の作用機構と癌発生・進展への関与

凋亡核变化调节因子p74的作用机制及其参与癌症发生和进展

基本信息

批准号：
13216055
负责人：
高橋淳
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)p74のメチル基転位酵素活性の検討p74に結合するタンパクとして酵母two-hybrid法で同定したp74BPは、組換え精製p74によりメチル化されなかった。RT-PCRでp74の発現が見出されない細胞株の抽出液に、p74を加えたが、新たなメチル化タンパクのバンドは見出されなかった。また、COS-7細胞に発現させmycタグに対する抗体で免疫沈降したp74でも同じ結果であった。ところが、最近得られた特異抗体で、RT-PCRでmRNAレベルで発現が検出できなかった細胞株に、内在性のp74タンパクが発現していることがわかった。細胞抽出液に、既に見いだされていたバンドの中に、すでに内在性のp74にメチル化されたものが含まれていた可能性がある。今後、p74がタンパクレベルで発現していない細胞の抽出液を用いて実験を進めていく予定である。(2)p74のポリアミン合成酵素活性の検討大腸菌内でp74をIPTGで誘導したが、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンの三種のポリアミンの増多は検出されなかった。mycタグを付けたp74を発現したCOS-7細胞にも三種のポリアミンの増多は検出されなかった。。しかし、大腸菌内のスペルミジン/プトレスシンの比率が、p74を発現した場合にわずかに上昇していたため、スペルミジン合成酵素である可能性をin vitroでの酵素測定系で検証した。decarboxylated S-adenosylmethionine、プトレスシン、組換え精製p74を反応させたが、p74のスペルミジン合成酵素としての活性は検出されなかった。(3)p74の造血器腫瘍における発現の解析種々の悪性リンパ腫の細胞株で、RT-PCRと、スタウロスポリンによるアポトーシスの誘導を行った。p74の発現量とアポトーシス細胞死に対する感受性には、逆相関が見られた。

(1)p74甲基转移酶活性的检查 p74BP是通过酵母二杂交法鉴定为与p74结合的蛋白质，但重组纯化的p74没有被甲基化。当将 p74 添加到 RT-PCR 未检测到 p74 表达的细胞系的提取物中时，没有发现新的甲基化蛋白条带。使用在 COS-7 细胞中表达的 p74 并用针对 myc 标签的抗体进行免疫沉淀，也获得了相同的结果。然而，使用最近获得的特异性抗体，发现内源性p74蛋白在通过RT-PCR无法在mRNA水平检测到表达的细胞系中表达。细胞提取物中已发现的条带可能含有甲基化的内源性 p74。将来，我们计划使用在蛋白质水平上不表达 p74 的细胞提取物进行实验。 (2)p74多胺合成酶活性的检查虽然用IPTG在大肠杆菌中诱导了p74，但没有检测到腐胺、亚精胺和精胺这三种多胺的增加。在表达 myc 标记的 p74 的 COS-7 细胞中未检测到三种多胺的增加。。然而，由于当p74表达时，大肠杆菌中的亚精胺/腐胺比率略有增加，因此使用体外酶测量系统验证了它是亚精胺合酶的可能性。尽管脱羧S-腺苷甲硫氨酸、腐胺和重组纯化的p74发生反应，但没有检测到p74作为亚精胺合酶的活性。 (3)造血肿瘤中p74表达的分析我们在各种恶性淋巴瘤细胞系中进行了RT-PCR和星形孢菌素诱导细胞凋亡。在 p74 表达水平和对凋亡细胞死亡的敏感性之间观察到负相关。