アポトーシス細胞死における核構造変化に関与する分子の同定

鉴定参与凋亡细胞死亡中核结构变化的分子

基本信息

批准号：
11770575
负责人：
高橋淳
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

アポトーシス核変化の制御因子p74とp66とに相互作用する分子として、p74BPとp66BPを酵母のTwo-hybrid法で平成11年度にクローニングした。本年度は、それらの細胞レベルでの相互作用と細胞内局在を検討し、特異抗体を作成するための抗原として精製タンパクを得た。(1)細胞内での相互作用p74BPをFLAGタグとの融合タンパクとして、全長のp74、p74のC末端側断片、p74N末端側断片をmycタグとの融合タンパクとして、COS-7細胞に発現した。FLAGタグに対する抗体で、myc-p74-N末端側断片が共沈降し、mycタグに対する抗体でmyc-p74-N末端側断片とFLAG-p74BPが共沈降した。p66BPとp66との共免疫沈降には、今の所、成功していない。一因は、p66が核外移行シグナルを有するために、下記のように核に局在するp66BPと結合できないためかもしれない。(2)細胞内局在p74、p66、p74BP、p66BPをGFPとの融合タンパクとして培養細胞に発現させ、共焦点顕微鏡により、傾向タンパクの細胞内分布を調べた。p74とp66は、細胞質にびまん性に分布していた。p74BPは、核膜周囲に顆粒状に分布していた。p66BPは、核に局在していたが、その分布は、点状であった。細胞にスタウロスポリンでアポトーシスを誘導したところ、p66は、細胞膜に移行した。(3)特異抗体の作成p74BPおよびp66BPを大腸菌にHisタグとの融合タンパクとして発現し、ニッケルカラムで精製することを試みたが、水溶性の条件では、精製不可能であった。そこで、グアニジンを用いた変性条件でニッケルカラムに結合させ、8M尿素を含む緩衝液で溶出したところ、高純度の精製標本を得たため、ウサギに免疫して特異抗体を作成中である。

P74BP和P66BP在1999财年以酵母双杂交方法作为控制因子p74和凋亡核变化的p66之间的相互作用。今年，检查了这些细胞和细胞内部的相互作用，并获得了精制蛋白作为创建特殊抗体的抗原。（1）在COS-7细胞中的COS-7细胞中可相互作用，作为具有标志标签的融合蛋白，p74，p74和p74n末端末端具有myc tag。标签标签的抗体，myc-p74-n端侧片段以及myc-p74-n端侧片段和国旗-P74bp的抗体用抗MyC标签的抗体进行了沉降。目前，p66bp和p66之间的CO免疫沉积尚未成功。部分是因为p66可能无法与p66bp结合，该p66bp位于核中，如下所示，因为p66具有核 - 核过渡信号。（2）细胞永恒的p74，p66，p74bp和p66bp在培养细胞中以具有GFP的融合蛋白表示，趋势蛋白的细胞内分布由CO -COCUS显微镜检查。 P74和P66分布在细胞中。 P74BP在核膜周围分布在颗粒状。 p66bp位于原子核中，但分布是一个虚线的形状。当用星形孢菌素诱导细胞凋亡时，p66转移到了细胞膜。（3）创建了一种特殊的抗体P74BP和P66BP作为融合蛋白与大肠杆菌及其标签，并试图用镍柱将其纯化，但是在水 - 溶解条件下，不可能净化。因此，使用鸟嘌呤在变性的程度下将其合并到镍柱中，当使用含有800万尿素的缓冲液获得高纯度纯化的标本时，它对兔子免疫并产生独特的抗体。