アポトーシス細胞死の核変化を制御する新規カスパーゼ基質p74の作用機構

控制凋亡细胞死亡中核变化的新型 caspase 底物 p74 的作用机制

基本信息

批准号：
12215073
负责人：
高橋淳
金额：
$ 3.01万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12215073/
关键词：
アポトーシスカスパーゼ FEAT-74 メチル基転位酵素

项目摘要

カスパーゼ3によるp74切断のアポトーシス核変化における役割カスパーゼ3を欠損している乳癌細胞株MCF7にN末端にmycタグを付けたp74を発現させ、スタウロスポリンでアポトーシスを誘導した。myc-p74の切断は、MCF7ではほとんど認められないが、myc-p74と同時にカスパーゼ3を共発現させると、2つの断片を生ずること、つまりカスパーゼ3により少なくとも2ケ所で切断されることが明らかになった。第一の部位は、断片のサイズから、2つのメチル基転位酵素様ドメインの間にあることが予想され、カスパーゼはアスパラギン酸のC末端側で切断することから、候補となる4ケ所のアスパラギン酸をアラニンに変える変異を導入し、ウサギ網状赤血球in vitro転写/翻訳システムで35Sラベルしたタンパクを合成して、カスパーゼ3による切断を調べところ、4ケ所のうち2ケ所(m1,m2)で切断されることがわかった。もう一つの切断部位は、N末端側のメチル基転位酵素様のドメインの内部にあることが予想されたため、候補となる3ケ所に変異を導入して、同様に調べたところ、そのうちの1ケ所(m3)の変異で切断が消失した。切断されない変異型p74をヒスチジン融合タンパクとして大腸菌に発現させ、ニッケルカラムで精製することを試みたが、水溶性の状態で発現させることには、成功しなかった。そこで、無細胞系ではなく、培養細胞で変異型p74の機能を解析した。野生型または変異型p74をコードするcDNAを、緑色蛍光タンパク(GFPをコードするcDNAと共に293Fas細胞に導入した後に、Fasに対する抗体でアポトーシス細胞死を誘導し、CFP発現細胞を選択して解析し、変異型p74の過剰発現のアボトーシス核変化に対する影響を調べた。野生型のp74は、アポトーシスに影響しなかったが、(m1+m2)変異のあるp74は、アポトーシスを抑制した。

caspase 3 裂解 p74 在细胞凋亡核变化中的作用我们在缺乏 caspase 3 的乳腺癌细胞系 MCF7 中表达 N 末端 myc 标记的 p74，并用十字孢菌素诱导细胞凋亡。在MCF7中几乎观察不到myc-p74的裂解，但是当caspase 3与myc-p74同时共表达时，显然产生了两个片段，即，caspase 3在至少两个位点被裂解。。根据片段的大小，第一个位点预计位于两个甲基转移酶样结构域之间，并且由于半胱天冬酶在天冬氨酸的 C 末端一侧裂解，因此我们引入了一个突变，将蛋白质改变为丙氨酸，使用兔网织红细胞体外转录/翻译系统合成了35S标记的蛋白质，并检查了caspase 3的切割。我们发现该蛋白质在四个位点中的两个（m1，m2）被切割。另一个切割位点预计位于N端侧的甲基转移酶样结构域内，因此我们在三个候选位点引入突变并进行相同的研究，发现其中一个（m3）突变废除了切割。我们尝试在大肠杆菌中将未切割的突变体p74表达为组氨酸融合蛋白，并使用镍柱对其进行纯化，但我们未能成功地将其以水溶性形式表达。因此，我们分析了突变体 p74 在培养细胞中的功能，而不是在无细胞系统中的功能。将编码野生型或突变型p74的cDNA与编码绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA一起引入293Fas细胞后，用针对Fas的抗体诱导细胞凋亡，并选择并分析表达CFP的细胞。突变型p74对细胞凋亡核变化的过度表达野生型p74对细胞凋亡没有影响，但具有(m1+m2)突变的p74抑制细胞凋亡。