標的遺伝子の自在な発現制御を可能とする人工オリゴヌクレオチドの開発

开发能够自由控制靶基因表达的人工寡核苷酸

基本信息

批准号：
13202036
负责人：
小比賀聡
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝情報の流れを遺伝子レベルで任意に制御できればどれほどすばらしいことか。これが現実のものとなれば、新規遺伝子の機能解析、遺伝子ネットワークの解明等に大きく寄与できることはいうまでもない。この夢の実現に最も近い方法としてアンチジーン法(オリゴヌクレオチド(ODN)を用いて特定のDNA二重鎖に三重鎖を形成させその機能を阻害する方法)が知られている。しかし、従来のODN類では、標的DNAのホモプリン配列にしか対応できず、しかも三重鎖の形成能が十分でないなど致命的な欠陥が山積していた。本研究では、これら問題点を解決すべく検討を行ない、以下のような知見を得た。[1]C並びにT塩基を認識する非天然型核酸類縁体として2-ピリドン、2-ヒドロキシベンゼンをそれぞれ選択し、これらを糖部コンホメーションを固定したリボース類縁体へ導入することで、目的とする新規ヌクレオシド類縁体の合成を達成した。[2]合成したヌクレオシド類縁体をアミダイト化した後にODNへと導入した。さらに、ホモプリン配列中に存在するC並びにT塩基を認識できるか否かについて、融解温度測定実験を行ない検討したところ、期待通りこれらヌクレオシド類は標的配列中に存在するC或いはT塩基と相互作用し安定な三重鎖核酸を形成した。[3]ルシフェラーゼ遺伝子の発現を指標に、培養細胞系における人工ODN(ホモプリン配列を標的としたもの)の遺伝子発現制御を評価する系を構築した。この系を用い検討を重ねた結果、ホモプリン配列を標的とした場合に人工ODNが遺伝子発現を効果的に抑制する事を見い出した。本研究では、ホモプリン配列を持つDNA中のCおよびT塩基と効果的に相互作用し安定な三重鎖形成を形成しうる修飾ODNの開発に成功した。これは従来のアンチジーン法に立ちふさがっていた大きな壁をまさに打破したもので、世界的にも非常に意義深い結果であると言える。

如果我们能够在基因层面任意控制遗传信息的流动，那该多好啊。不言而喻，如果这成为现实，将对新基因的功能分析和基因网络的阐明做出巨大贡献。反基因法（一种利用寡核苷酸（ODN）在特定DNA双链体中形成三链体并抑制其功能的方法）被称为最接近实现这一梦想的方法。然而，传统的ODN只能响应靶DNA中的同型嘌呤序列，并且存在许多致命缺陷，例如形成三链体的能力不足。在本研究中，我们进行了调查以解决这些问题并获得了以下发现。 [1]通过选择2-吡啶酮和2-羟基苯作为识别C和T碱基的非天然核酸类似物，并将其引入具有固定糖部分构象的核糖类似物中，实现了新型核苷类似物的合成。 [2] 将合成的核苷类似物转化为amidites，然后引入ODN。此外，我们进行了解链温度测量实验，以检查是否可以识别高嘌呤序列中存在的C和T碱基，并且正如预期的那样，这些核苷与目标序列中存在的C或T碱基相互作用，得到了稳定的三链体核酸。形成。 [3]以荧光素酶基因表达为指标，我们构建了一个系统来评估人工ODN（靶向高嘌呤序列）在培养细胞系中的基因表达控制。通过使用该系统进行反复研究，我们发现人工 ODN 在靶向高嘌呤序列时可有效抑制基因表达。在本研究中，我们成功开发了一种修饰的ODN，它可以有效地与具有高嘌呤序列的DNA中的C和T碱基相互作用，形成稳定的三链体。这一结果真正突破了传统反基因方法的重大障碍，可以说是全球范围内极其重要的结果。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Torigoe, H., Hari, Y., Sekiguchi, M., Obika, S., Imanishi, T.: "2'-O,4'-C-Methylene Bridged Nucleic Acid Modification Promotes Pyrimidine Motif Triplex DNA Formation at Physiological pH : Thermodynamic and Kinetic Studies"J. Biol. Chem.. 276・4. 2354-2360

Torigoe, H.、Hari, Y.、Sekiguchi, M.、Obika, S.、Imanishi, T.：“2-O,4-C-亚甲基桥核酸修饰促进嘧啶基序三链体 DNA 在生理 pH 值下的形成：热力学和动力学研究“J. Biol. Chem.. 276・4. 2354-2360

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Obika, S., Uneda, T., Sugimoto, T., Nanbu, D., Minami, T., Doi, T.Imanishi, T.: "2'-O,4'-C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA): Synthesis and Triplex-forming Properties"Bioorg. Med. Chem.. 9・4. 1001-1011 (2001)

Obika, S.、Uneda, T.、Sugimoto, T.、Nanbu, D.、Minami, T.、Doi, T.Imanishi, T.：“2-O,4-C-亚甲基桥核酸（ 2,4-BNA)：合成和三链体形成性质“Bioorg.Med.Chem..9・4.1001-1011(2001)

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Obika, S., Hari, Y., Sekiguchi, M., Imanishi, T.: "Eine 2',4'-verbruckte Nucleinsaure mit 2-Pyridon als Nucleobase : effiziente Erkennung einer C・G-Unterbrechung durch Triplexbildung mit einem Pyrimidinmotiv"Angew. Chem.. 113・11. 2149-2151 (2001)

Obika, S.、Hari, Y.、Sekiguchi, M.、Imanishi, T.：“Eine 2,4-verbruckte Nucleinsaure mit 2-Pyridon als Nucleobase : effiziente Erkennung einer C・G-Unterbrechung durch Triplexbildung mit einem Pyrimidinmotiv 《Angew.化学..》113・11.2149-2151 (2001)