遺伝子発現の時空間制御を目的とした外部刺激応答性スイッチの開発

开发用于基因表达时空控制的外部刺激响应开关

• 批准号: 20655038
• 负责人: 小比賀 聡
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20655038/
• 关键词: 分子スイッチ; 人工核酸; 光感受性; レドックス; 機能性RNA; 遣伝子制御; 遺伝子制御

遺伝子発現のON/OFFを制御するシステム構築目指し、遺伝子発現のタイミングを決めることが出来る遺伝子スイッチ(外部刺激応答性人工核酸モノマー)の開発について検討し、以下の成果を得た。まず、酸化還元状態の変化を外部刺激として動作する遺伝子スイッチ本体としてジスルフィド結合を有する人工核酸を設計し、H20年度に設定した安価なD-グルコースから調製可能な4'-修飾RNA誘導体を用いることで効率的にその人工核酸モノマーの合成を達成した。さらに、その人工核酸モノマーが生体内レドックス因子であるグルタチオンや過酸化水素などに応答してそれ自身の化学構造を可逆的に変化させる事を示し、レドックススイッチとして機能することを確認した。続いて、H20-21年度にかけて開発に成功した光応答性スイッチとレドックススイッチをDNA自動合成機によりオリゴヌクレオチドへ導入し、HPLCによる精製とMALDI-TOF-MS等の分析技術を駆使してその分子組成が正しい事を確認した。導入したスイッチ分子の核酸スイッチ機能を相補鎖核酸に対する結合親和性や核酸分解酵素耐性能等の変化で評価したところ、光応答性スイッチとして設計したスイッチ分子は5秒間の紫外線照射と生体成分グルタチオンの2成分を外部刺激としてその二重鎖形成能や酵素耐性能を2段階で調節する事が分かった。一方で、レドックススイッチとして設計したスイッチ分子もまた、各種酸化還元剤添加を外部刺激としてオリゴヌクレオチドの二重鎖形成能を大きく変化させる事を明らかとした(ΔT_m ca.15℃/mod.)。以上のように本研究では「いつでも我々のタイミング(光刺激)で」または「生体内環境の変化(グルタチオン濃度や酸化還元電位の変化)に応じて」オリゴヌクレオチドの機能のON/OFFを制御する遺伝子スイッチの開発に成功した。遺伝子発現制御法が'遺伝子発現破壊法'である現状を'真の遺伝子発現を制御'に近づける大きな一歩である。

为了构建控制基因表达ON/OFF的系统，我们研究了可以确定基因表达时间的基因开关（对外部刺激做出反应的人工核酸单体）的开发，并获得了以下结果。首先，我们设计了一种具有二硫键的人工核酸作为基因开关的主体，该基因开关利用氧化还原状态的变化作为外部刺激进行操作，并使用了可以从廉价的D-葡萄糖制备的4'-修饰的RNA衍生物，我们在2008年设定的。我们实现了人工核酸单体的高效合成。此外，人工核酸单体被证明可以响应体内氧化还原因子（例如谷胱甘肽和过氧化氢）而可逆地改变其化学结构，证实其具有氧化还原开关的功能。接下来，我们将2009年至2009财年成功开发的光响应开关和氧化还原开关引入使用自动DNA合成仪的寡核苷酸中，并使用HPLC和MALDI-TOF-MS等分析技术纯化分子。我确认构图是正确的。通过与互补链核酸的结合亲和力的变化和核酸水解酶抗性等评价引入的开关分子的核酸开关功能，将设计为光响应开关的开关分子暴露于紫外线照射5秒，生物成分研究发现，两种成分的双链形成能力和酶抗能力是通过外部刺激分两步调节的。另一方面，设计为氧化还原开关的开关分子也被发现在添加各种氧化还原剂的外部刺激下显着改变寡核苷酸的双链体形成能力（ΔT_m ca.15℃/mod.）。如上所述，本研究旨在“在我们自己的时间（光刺激）的任何时间”或“响应体内环境的变化（谷胱甘肽浓度和氧化还原电位的变化）控制寡核苷酸功能的开/关” ）''。这是使当前的基因表达控制方法（即“基因表达破坏方法”）更接近“基因表达的真正控制”的重要一步。

项目成果

機能性アンチセンス分子による核酸医薬の開発

利用功能性反义分子开发核酸药物

• 发表时间: 2009
• 作者: eruhisa Ohno;Naoya Murakami;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

機能性人工核酸の創製とその応用

功能性人工核酸的制备及其应用

• 发表时间: 2009
• 作者: Kunihiko Morihiro(研究補助);Kunihiko Morihiro(研究補助);Takeshi Baba(研究補助);Yasunori Mitsuoka;小比賀聡;小比賀聡;兒玉哲也;小比賀聡;小比賀聡;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

カルバマート骨格を有する新規架橋型人工核酸の合成とその評価

新型氨基甲酸酯骨架交联人工核酸的合成与评价

• 发表时间: 2008
• 作者: Y. Kawada;T. Yamaguchi;K. Miyashita;S. Obika;T. Imanishi;西田勝
• 通讯作者: 西田勝

Synthesis of Light-Responsive Bridged Nucleic Acid and Changes in Affinity with Complementary ssRNA

光响应性桥接核酸的合成以及与互补 ssRNA 的亲和力变化

• 发表时间: 2009
• 期刊: ChemBioChem 10
• 作者: DOHI;Toshifumi;et.al.;Kunihiko Morihiro(研究補助)
• 通讯作者: Kunihiko Morihiro(研究補助)

核酸分子のキラリティー制御とその応用

核酸分子的手性控制及其应用

• 发表时间: 2009
• 作者: Kunihiko Morihiro(研究補助);Kunihiko Morihiro(研究補助);Takeshi Baba(研究補助);Yasunori Mitsuoka;小比賀聡;小比賀聡;兒玉哲也;小比賀聡;小比賀聡;小比賀聡;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡