遺伝子発現の時空間制御を目的とした外部刺激応答性スイッチの開発

开发用于基因表达时空控制的外部刺激响应开关

• 批准号: 20655038
• 负责人: 小比賀 聡
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20655038/
• 关键词: 分子スイッチ; 人工核酸; 光感受性; レドックス; 機能性RNA; 遣伝子制御; 遺伝子制御

遺伝子発現のON/OFFを制御するシステム構築目指し、遺伝子発現のタイミングを決めることが出来る遺伝子スイッチ(外部刺激応答性人工核酸モノマー)の開発について検討し、以下の成果を得た。まず、酸化還元状態の変化を外部刺激として動作する遺伝子スイッチ本体としてジスルフィド結合を有する人工核酸を設計し、H20年度に設定した安価なD-グルコースから調製可能な4'-修飾RNA誘導体を用いることで効率的にその人工核酸モノマーの合成を達成した。さらに、その人工核酸モノマーが生体内レドックス因子であるグルタチオンや過酸化水素などに応答してそれ自身の化学構造を可逆的に変化させる事を示し、レドックススイッチとして機能することを確認した。続いて、H20-21年度にかけて開発に成功した光応答性スイッチとレドックススイッチをDNA自動合成機によりオリゴヌクレオチドへ導入し、HPLCによる精製とMALDI-TOF-MS等の分析技術を駆使してその分子組成が正しい事を確認した。導入したスイッチ分子の核酸スイッチ機能を相補鎖核酸に対する結合親和性や核酸分解酵素耐性能等の変化で評価したところ、光応答性スイッチとして設計したスイッチ分子は5秒間の紫外線照射と生体成分グルタチオンの2成分を外部刺激としてその二重鎖形成能や酵素耐性能を2段階で調節する事が分かった。一方で、レドックススイッチとして設計したスイッチ分子もまた、各種酸化還元剤添加を外部刺激としてオリゴヌクレオチドの二重鎖形成能を大きく変化させる事を明らかとした(ΔT_m ca.15℃/mod.)。以上のように本研究では「いつでも我々のタイミング(光刺激)で」または「生体内環境の変化(グルタチオン濃度や酸化還元電位の変化)に応じて」オリゴヌクレオチドの機能のON/OFFを制御する遺伝子スイッチの開発に成功した。遺伝子発現制御法が'遺伝子発現破壊法'である現状を'真の遺伝子発現を制御'に近づける大きな一歩である。

为了构建控制基因表达开/关的系统，我们研究了可以确定基因开关（外部刺激反应性人造核酸单体）的发展，该核酸单体可以确定基因表达的时间，并实现了以下结果。首先，将具有二硫键的人造核酸设计为基因开关主体，其在氧化还原状态下以外部刺激的形式进行操作，并且通过使用4'MODIFIED RNA衍生物，可以从2008年廉价的D-葡萄糖套装中制备，该d-d-葡萄糖在2008年固定，人工核酸单组有效地合成了人工核酸单位。此外，已经证实，人造核酸单体可逆地改变其自身的化学结构，以响应体内氧化还原因子（例如谷胱甘肽和过氧化氢），并且它作为氧化还原开关的作用。接下来，使用自动DNA合成器引入了2000 - 2001年成功开发的光反应开关和氧化还原开关，并使用HPLC纯化和分析技术（例如MALDI-TOF-MS）证实了分子组成是正确的。当评估引入开关分子的核酸转换功能基于互补链核酸的结合亲和力的变化以及对核酸降解酶的抗性时，发现开关分子设计为光响应性转换的二级综合能力和enzyme promantiation 5 sepents and inzyme and inzyme promination for Inraviriation forif and comportiation 5谷胱甘肽作为外部刺激。另一方面，设计为氧化还原开关的开关分子也已显示出使用添加各种降低氧化剂的刺激（ΔT_MCa.15°C/mod。）的寡核苷酸形成双链的能力。如上所述，这项研究成功地开发了一种基因开关，该基因开关控制了寡核苷酸功能的ON/OFF，“在我们的时机（光刺激）（光刺激）或“响应体内环境的变化响应谷胱甘肽浓度或氧化浓度减少或减少氧化的变化）是为了实现Gene表达控制的主要步骤。

项目成果

機能性人工核酸の創製とその応用

功能性人工核酸的制备及其应用

• 发表时间: 2009
• 作者: Kunihiko Morihiro(研究補助);Kunihiko Morihiro(研究補助);Takeshi Baba(研究補助);Yasunori Mitsuoka;小比賀聡;小比賀聡;兒玉哲也;小比賀聡;小比賀聡;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

機能性アンチセンス分子による核酸医薬の開発

利用功能性反义分子开发核酸药物

• 发表时间: 2009
• 作者: eruhisa Ohno;Naoya Murakami;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

Synthesis and properties of a novel artificial nucleoside that acts as a redox switch.

作为氧化还原开关的新型人工核苷的合成和特性。

• DOI: 10.1093/nass/nrp054
• 发表时间: 2009
• 期刊: Nucleic acids symposium series
• 作者: Takeshi Baba;T. Kodama;T. Imanishi;S. Obika
• 通讯作者: S. Obika

カルバマート骨格を有する新規架橋型人工核酸の合成とその評価

新型氨基甲酸酯骨架交联人工核酸的合成与评价

• 发表时间: 2008
• 作者: Y. Kawada;T. Yamaguchi;K. Miyashita;S. Obika;T. Imanishi;西田勝
• 通讯作者: 西田勝

Synthesis of Light-Responsive Bridged Nucleic Acid and Changes in Affinity with Complementary ssRNA

光响应性桥接核酸的合成以及与互补 ssRNA 的亲和力变化

• 发表时间: 2009
• 期刊: ChemBioChem 10
• 作者: DOHI;Toshifumi;et.al.;Kunihiko Morihiro(研究補助)
• 通讯作者: Kunihiko Morihiro(研究補助)