ウイルス性がん遺伝子産物による転写コアクチベーターの機能制御

病毒癌基因产物对转录共激活因子的功能调节

• 批准号: 01J03339
• 负责人: 改田 厚
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J03339/
• 关键词: ウイルス性がん遺伝子; 転写コアクチベーター; CBP; p300; 核酸生合成

本研究においてCBP,p300のKIX領域のGST融合タンパク質を大腸菌にて作製し、代謝標識したJurkat細胞抽出液を用いてGST-pull down assayを行った。その結果、p300のKIX領域特異的に結合する細胞性因子を見い出した。二次元電気泳動による分離後、質量解析により同定を試みた結果、標的タンパク質は、核酸生合成に関与するphosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 (PRS1)であることが判明した。CBP,p300とPRS1との関係について現在までに以下の新たな知見を得た。1.p300分子内のPRS1結合領域の決定in vitroで合成した[^<35>S]-methionine代謝標識のPRS1を用いてGST-pull down assayを行った結果、p300のPRS1結合領域は567番目のアミノ酸から652番目のアミノ酸の間に存在することが示唆された。2.mammalian two hybrid systemを用いた全長CBP、p300とPRS1の結合検討mammalian two hybrid systemは、Gal4 DNA結合領域に融合させたXタンパク質とVP16に融合させたYタンパク質において培養細胞内で結合するとレポータープラスミドが反応し、ルシフェラーゼ活性の上昇が検出される系である。培養細胞株のMCF7細胞にGal4DNA結合領域に融合したPRS1、VP16に融合させたCBPまたはp300を遺伝子導入後、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、VP16-p300のみルシフェラーゼ活性の上昇が検出された。さらにp300のPRS1結合領域を欠失させた変異体p300では、ルシフェラーゼ活性の上昇が検出されなかったことからPRS1はp300特異的に結合することが示唆された。3.PRS1分子内のp300結合領域の決定およびp300(KIX)に結合しない点変異体PRS1の作製PRS1はp300(KIX)領域に結合するがPRS1とアミノ酸レベルにおいて94%のホモロジーを有するPRS2は結合しないことが判明した。PRS1とPRS2のキメラタンパク質発現プラスミドを作製し、in vitroで合成した[^<35>S]-methionine代謝標識のキメラタンパク質を用いてGST-pull down assayを行った結果、PRS1の170番目のアミノ酸から190番目のアミノ酸がp300(KIX)との結合に重要であることが判明した。PRS1の点変異体を用いた解析からPRS1の188番目のアミノ酸がp300(KIX)との会合に重要であり、PRS1の点変異体PRS1(D188E)では、その結合能が顕著に低下した。現在、PRS1,PRS2,PRS1(D188E)を用いて、CBP,p300それぞれのヒストンアセチル化活性、転写コアクチベーター能に及ぼす影響について検討中である。

在本研究中，在大肠杆菌中产生了 CBP KIX 区域的 GST 融合蛋白 p300，并使用代谢标记的 Jurkat 细胞提取物进行了 GST-pull down 测定。结果，我们发现了一种与 p300 的 KIX 区域特异性结合的细胞因子。二维电泳分离后，质谱鉴定，目的蛋白为磷酸核糖焦磷酸合成酶1（PRS1），参与核酸生物合成。迄今为止，我们获得了以下关于 CBP、p300 和 PRS1 之间关系的新发现。 1. p300分子内PRS1结合区的测定使用体外合成的[^ 35 S]-甲硫氨酸代谢标记的PRS1进行GST-pull down测定，结果鉴定出p300的PRS1结合区位于以下位置： 567.有人提出它存在于第652个氨基酸和第652个氨基酸之间。 2.使用哺乳动物双杂交系统检查全长CBP、p300和PRS1的结合。这是一个质粒发生反应并检测到荧光素酶活性增加的系统。将与 Gal4 DNA 结合区融合的 PRS1、与 VP16 融合的 CBP 或 p300 基因导入培养的细胞系 MCF7 细胞后，进行荧光素酶测定。结果，仅在VP16-p300中检测到荧光素酶活性增加。此外，在 p300 的 PRS1 结合区被删除的突变体 p300 中没有检测到荧光素酶活性增加，这表明 PRS1 与 p300 特异性结合。 3. 确定 PRS1 分子内的 p300 结合区域并创建不与 p300(KIX) 结合的点突变 PRS1。 PRS1 与 p300(KIX) 区域结合，但与 PRS1 具有 94% 同源性的 PRS2 结合。氨基酸水平，事实证明不是。制作PRS1和PRS2的嵌合蛋白表达质粒，并使用体外合成的[^ 35 S]-甲硫氨酸代谢标记的嵌合蛋白进行GST-pull down测定，结果发现，PRS1和PRS2的第170位氨基酸PRS1 第 190 个氨基酸被发现对于与 p300(KIX) 的结合很重要。使用PRS1点突变体的分析表明，PRS1的第188位氨基酸对于与p300(KIX)的结合很重要，并且PRS1点突变体PRS1(D188E)的结合能力显着降低。我们目前正在研究 PRS1、PRS2 和 PRS1(D188E) 分别对 CBP 和 p300 的组蛋白乙酰化活性和转录共激活子能力的影响。

项目成果

Yasuo Ariumi: "Distinct nuclear body components, PML and SMRT, regulate the trans-acting function of HTLV-1 Tax oncoprotein"ONCOGENE. 22. 1611-1619 (2003)

Yasuo Ariumi：“不同的核体成分，PML 和 SMRT，调节 HTLV-1 Tax 癌蛋白的反式作用功能”ONCOGENE。