クロマチン鋳型からの転写に必須なCBP/p300を含む複合体の精製とその機能

染色质模板转录必需的含 CBP/p300 复合物的纯化及其功能

基本信息

批准号：
11770067
负责人：
池田啓子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

<研究目的>転写は、基本転写因子群によって行われる基本転写と、上流域結合因子群と基本転写因子群との協同作用による制御転写にわけて考えることができる。筆者は試験管内再構成転写系を用いて制御転写の転写活性化および抑制化機構の解析を行ってきた。その中で今までに報告されている再構成転写系における転写活性化は、因子の活性化ドメインの特異性が反映されないという点において、形質転換法等で観察される細胞内での転写活性化とは明らかに異なることを発見した。細胞内で観察される転写活性化機構を明らかにするべく、核抽出液の調製法から検討し、強力なVP16活性化ドメインに特異的なコアクチベーターの精製を試みた。<実施状況>VP16の活性化ドメインをさらにN末部分(以下H1ドメイン;アミノ酸412-456)とC末部分(以下H2ドメイン;アミノ酸453-490)に分けた。2つのサブドメインは培養細胞を用いた一過性形質転換法による転写活性化様式に違いがあることから、ドメイン特異的な因子またはメカニズムを通じた転写活性化であると示唆された。従来のDignam法によらず、Low Salt法(Ikeda,K.＆ Meisterernst,M)により調製されたHeLaS核抽出液にVP16H1ドメインに依存的な活性が再現性よく観察された。コンベンショナルなカラムとアフィニティカラムを使用し、裸およびクロマチンDNA鋳型の試験管内転写系を用いてそれぞれのサブドメインを通じて作用するコアクチベーターを探索した。前者のドメインにはMediator ComplexであるSMCCが結合し裸のDNA鋳型からの転写を担う。後者のドメインにはSMCCとCBP/p300が結合しクロマチンDNA鋳型からの転写を担うことが明らかになった。

<研究目的>转录可以通过对照转移来考虑通过在基本转录因子组执行的基本转移因子组之间进行的控制转移，以及通过在上盆地结合因子组和基本转录因子组之间合作的控制转移。作者一直在使用测试管中的转录系统分析转录激活和控制转移的抑制作用机制。其中，到目前为止报道的重建转录系统中的转录激活并不能反映因子激活结构域的特殊性。为了阐明在细胞中观察到的转录激活机制，我们从核提取物的制备方法中检查，并试图在强大的VP16激活结构域中净化特定的核心点。 <实施状态> VP16激活结构域分为N端（以下简称H1域；氨基酸412-456）和C的末端（H2域；氨基酸453-490）。由于使用培养细胞的瞬态转化方法在转录激活样式上具有差异，因此建议它是通过域特异性因子或机制的转录激活。不管常规迪格am方法如何，通过低盐法（Ikeda，K。）制备的HELAS核提取物。使用常规的列和亲和力柱，我们使用裸露和染色质DNA模制试管转录系统搜索了通过每个子域作用的核心贴纸。在以前的域中，SMCC是一个调解人建筑群，并负责从裸露的DNA模具转移。据显示，将SMCC和CBP/P300合并到后一个结构域中，从染色质DNA霉菌转移。