試験管内転写系を用いた新規コアクチベーターの解析

使用体外转录系统分析新型共激活剂

基本信息

批准号：
12028231
负责人：
池田啓子
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12028231/
关键词：
試験管内転写 VP16 Eya クロマチン転写

项目摘要

<研究背景>転写は、基本転写因子群によって行われる基本転写と、上流域結合因子群と基本転写因子群との協同作用による制御転写にわけて考えることができる。細胞内で観察される転写活性化機構の分子的実体を明らかにするべく、1)転写活性化モデルとして使用されている強力な転写活性化因子であるヘルペスウイルス蛋白質VP16活性化ドメインの、コアクチベーターの精製2)ほ乳類生体内に存在し目や筋肉の発生に関係するEyaコアクチベーターの複合体の精製を行った。<実施状況>1)VP16の活性化ドメインをさらにH1ドメインとH2ドメインに分けた。2つのサブドメインは培養細胞をいた一過性形質転換法による転写活性化様式に違いがあることから、ドメイン特異的な因子またはメカニズムを通じた転写活性化であると示唆された。従来のDignam法によらず、Low Salt法(Ikeda,K.＆ Meisterernst,M)により調製されたHeLaS核抽出液にVP16H1ドメインに依存的な活性が再現性よく観察された。裸およびクロマチンDNA鋳型の試験管内転写系を用いてそれぞれのサブドメインを通じて作用するコアクチベーターを探索した。前者のドメインにはMediator ComplexであるSMCCが結合し裸のDNA鋳型からの転写を担う。後者のドメインにはSMCCとCBP/p300が結合しクロマチンDNA鋳型からの転写を担うことが明らかになった。2)HeLa細胞の核抽出液300mlから、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等を用いて、Eyaを含む複合体を精製した。同複合体は、SDS-PAGEにて6つのポリペプチドから成ることが示唆された。終精製画分は、Sixタンパク質存在下、裸およびクロマチンDNAを鋳型にした試験管内転写系では転写活性化能を有しなかった。

<研究背景> 转录可分为两种类型：由一组基本转录因子进行的基本转录，以及由一组上游结合因子和一组基本转录因子协同作用控制的转录。为了阐明在细胞中观察到的转录激活机制的分子实质，我们的目的是：1）共同激活疱疹病毒蛋白VP16的激活结构域，这是一种用作转录激活模型的强转录激活因子2）我们纯化了 Eya 共激活剂复合物，该复合物存在于哺乳动物中，参与眼睛和肌肉的发育。 <实施状况> 1) VP16的激活结构域进一步分为H1结构域和H2结构域。这两个子域在培养细胞中瞬时转化的转录激活模式上有所不同，这表明转录激活是通过域特异性因子或机制发生的。在通过低盐方法（Ikeda, K. & Meisterernst, M）制备的 HeLaS 核提取物中观察到 VP16H1 结构域依赖性活性，具有良好的重现性，无需使用传统的 Dignam 方法。我们在体外转录系统中使用裸 DNA 和染色质 DNA 模板来探索通过每个子域发挥作用的共激活因子。介体复合体 SMCC 与前一个结构域结合，负责从裸 DNA 模板进行转录。结果表明，SMCC 和 CBP/p300 与后一个结构域结合，负责从染色质 DNA 模板进行转录。 2)使用离子交换柱、凝胶过滤柱等从300ml HeLa细胞核提取物中纯化含有Eya的复合物。 SDS-PAGE表明该复合物由六种多肽组成。在使用裸DNA和染色质DNA作为模板的体外转录系统中，在六蛋白存在下，最终纯化的级分不具有转录激活能力。