人类单纯疱疹病毒I型在用CRISPR技术构建的OCT-1-/-细胞中的感染抑制及其分子机理的研究

Human simplex virus type 1 (HSV-1) is among the most studied viruses in Herpesviridae. HSV-1 genome expression is under tight and complex regulations on both spatial and temporal levels, by viral and host proteins and RNAs, viral DNA regulatory elements, viral genome chromatin structure etc.. Among all, VP16 induced complex(VIC), including host protein HCF-1 and OCT-1 and viral protein VP16, plays an essential role in regulating viral gene expression in most stages of viral life cycles. To investigate HSV-1 pathogenesis in the absence of VIC, our group has established a human OCT-1-/- cell line, using CRISPR technique. The following preliminary discoveries were observed:1. HSV-1 replication and spreading were restricted in OCT-1-/-cells; 2. HSV-1 immediate early protein ICP0 level was down-regulated in OCT-1-/-cells; 3. Heat-shock greatly up-regulated ICP0 protein level in infected OCT-1-/-cells. This project is proposing to fully validate these findings and to investigate 1. the interplay of ICP0 protein level and the restricted replication of HSV-1 in OCT-1-/-cells; 2. The effect of heat-shock on HSV-1 replication in OCT-1-/-cells and the mechanisms of the "activated" ICP0 expression by heat-shock in OCT-1-/-cells.

人类单纯疱疹病毒I型（HSV-1）是疱疹家族最被深入研究的病毒之一。HSV-1基因组的转录表达受病毒和宿主蛋白、RNA、病毒DNA序列及病毒基因组结构在空间上和时间顺序上的复杂调控，其中由HCF-1、OCT-1和病毒蛋白VP16构成的VP16诱导复合体（VIC）具有关键转录调控作用。为了研究在VIC复合体缺失情况下HSV-1的感染表型，本项目通过CRISPR技术，在人源细胞上构建了OCT-1-/-细胞系，并发现1.病毒复制和扩散受到抑制；2.HSV-1急早期蛋白ICP0表达量下调；3.热激能在OCT-1-/-细胞中显著提高ICP0的蛋白表达量。项目团队希望完善前期工作基础并：1.研究ICP0表达量与HSV-1的复制抑制间的关系，探索OCT-1缺失抑制HSV-1感染的分子机制。2.探索热激在OCT-1-/-细胞中对HSV-1感染的影响及其诱导ICP0蛋白表达的分子机制。

人类单纯疱疹病毒I型（HSV-1）为典型的双链DNA病毒，是引起口唇疱疹的主要病原体。该病毒具有高度人间流行性，能在被感染宿主体内潜伏终身并伴随高频率自主性复发，引发包括疱疹病毒性角膜炎，疱疹病毒性脑炎等严重病症。由病毒蛋白VP16和宿主蛋白HCF-1及OCT-1组成的virus induced complex (VIC复合体)被认为是调控HSV-1在神经细胞中进入潜伏感染的重要蛋白复合物。本项目希望在人源细胞HEp-2的基础上建立OCT-1蛋白的完全缺失单克隆细胞系（OCT-1-/-），探索HSV-1在无法诱导完整VIC蛋白复合物的细胞中的复制情况和利用OCT-1-/-建立HSV-1体外“潜伏感染”模型的可能性。课题组在项目进行过程中，利用CIRPSR/cas9基因敲除技术，引进领域内前沿的HSV-1体外“潜伏感染”神经细胞模型，运用高效的外泌体囊泡和病毒颗粒分离技术，揭示了在OCT-1完全敲除单克隆细胞系中，虽然HSV-1病毒的裂解性复制受到极大抑制，但病毒依然能有效表达即刻早期基因，说明在上皮细胞中以OCT-1为核心成分的VIC复合体不是病毒基因转录起始的必须条件。本项目进而证明HSV-1感染有效促进上皮细胞中OCT-1蛋白，而不是VIC复合体中另外的重要蛋白HCF-1, 通过外泌体像细胞外的特异性分泌，揭示了HSV-1在感染上皮细胞的过程中向神经元细胞活跃输送宿主因子OCT-1蛋白，以促进病毒浸染神经元细胞的新颖分子机制，开辟了研究HSV-1感染的上皮细胞与HSV-1感染神经元之间的细胞间交流与互作的新方法和新模式。为全面理解HSV-1病毒由侵染上皮细胞后进一步进入神经元细胞进行感染和潜伏的复杂过程及其中的庞大分子互作网络提供新证据及新补充。

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