グルココルチコイドによる組織特異的作用発現のメカニズム〜転写共役因子からの検討〜

糖皮质激素表达的组织特异性作用机制〜转录辅助因子的检查〜

基本信息

批准号：
10770559
负责人：
柴田洋孝
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

グルココルチコイド(GC)は,細胞質にあるグルココルチコイドレセプター(GR)に結合すると,熱ショック蛋白が解離して核内へ移行し,さらに二量体を形成して,標的遺伝子のGC応答配列(GRE)に結合することによりその遺伝子の転写活性化を引き起こす。そして,GC作用は,ホルモンとそのレセプターGRに加えて,転写共役因子(コアクチベーター)がGRに動員結合することにより,ホルモン作用の強弱が調節されることが示されている。そこでまず初めに,内因性にGRが存在しない腎臓線維芽細胞由来COS-1細胞において,GRE-luciferaseをレポーター遺伝子として用いたTransient transfection assayにより,コアクチベーターの機能を検討した。,デキサメサゾン(DEX)の濃度を上げても,GRを発現させないとGR作用を認めなかった。次に,GRを外因性に発現させてDEX濃度を上昇させると,濃度依存性にGR作用の増加を認めた。そこに,外因性にコアクチベーターSRC-1を過剰発現させると,DEX依存性のGR作用がさらに5-〜10倍に増強された。しかし,GRとSRC-1を過剰発現させてもDEXを加えないとGR作用は全く消失した。以上の結果より,(1)GR作用の発現にはホルモン,GRおよびコアクチベーターの三者が必須であること,(2)またコアクチベーターは細胞内に内因性に存在するが飽和していないこと,(3)コアクチベーターの細胞内発現量の変化は,GR作用の増幅効果があること,(4)ホルモンがGRに結合しなければコアクチベーター単独ではGR作用を発現できないことが明らかとなった。この結果から,ホルモン処置によりコアクチベーターそのものの発現量が変化すれば,ホルモン作用の発現に大きな影響を与える調節機構となると考えられ,以下の研究を進めた。そこで,本年はin vitroでラット腎メサンジウム細胞を用いてその調節を詳細に検討した。10^<-6>MのDEX処置にてNorthern blotでは2〜4時間後にSRC-1 mRNAレベルのdown-regulationを認めた。さらに,抗SRC-1ペプチド抗体を用いたWestern blotでは約6時間後にSRC-1タンパクのdown-regulationを認めた。GCにより腎臓メサンジウム細胞でコアクチベーターSRC-1の遺伝子転写レベルでのdown-regulationが明らかとなった。しかし,腎臓全体の中でメサンジウム細胞の占める割合は少なく,腎臓全体の約90%を占める尿細管細胞での調節を検討するために,マウス近位尿細管由来MCT-1細胞において同様の検討を行ったところ,10^<-7>〜10^<-6>MのDEX処置によりタンパクレベルで明らかなSRC-1のdown-regulationを認めた。したがって,in vivoのラット腎臓において認めたSRC-1のdown-regulationは,in vitroにおいても近位尿細管およびメサンジウム細胞においてmRNAおよびタンパクレベルにて確認された。以上の結果を考え合わせると,腎臓においてGC投与に対してその作用が過剰に持続しないように生体防御的にGRおよびコクチベーターのSRC-1がdown-regulationされていることが推察された。今後,SRC-1遺伝子のプロモーター領域にGREが存在するか否かなどの検討により,down-regulationの詳細な機序が明らかになることが期待される。

糖皮质激素（GC）是细胞质中的糖皮质激素受体（GR）。除了激素和受体GR外，GC作用还表明激素作用的强度通过将转移教练（核心激活剂）动员到GR进行调节。因此，首先，在源自内源性GR的肾脏成纤维细胞细胞的COS-1细胞中，通过使用GRE-luciferase作为报告基因的瞬时转染测定法检查了核心激活剂的功能。即使提高了Dexa Samezon（DEX）的浓度，除非表达GR，否则也无法识别GR效应。接下来，当GR以外部原因表达并增加DEX浓度时，GR作用依赖于浓度依赖性。在外部因素中过高的核心广告SRC-1，DEX依赖性的GR效应进一步增加了5至10倍。但是，即使GR和SRC-1过分，GR效应也消失了而无需添加DEX。基于上述结果，（1）三人，GR和Koakuchi需要GR动作的表达，并且（2）核心更好，但无饱和。核激活物的表达可能具有GR作用的扩增的作用，（4）除非将激素键合到GR，否则核心效应不能单独用核心激活物表示。基于此结果，如果核心殴打者本身由于激素治疗而变化，则认为这将是一种调节机制，对激素作用的表达产生了重大影响，并且已经进行了以下研究。因此，今年的体外，使用大鼠肾脏Masaum细胞进行了详细的调整。在10^<-6> m的DEX处理中，北印迹在2至4小时后识别出SRC-1 mRNA mRNA下的下调。此外，使用抗SRC-1肽抗体的蛋白质印迹承认SRC-1蛋白下调。 GC揭示了在肾小球细胞中核心AD-1基因转移水平下的下调。但是，为了考虑用尿管细胞调节，该细胞约占整个肾脏的90％，整个肾脏中的小鼠衍生的MCT-1细胞。 SRC-1的调节，这在10^<-7> 〜10^<-6> m的Tumper级DEX处理中显而易见。因此，在短尿管和金属细胞的体外，在体内大鼠肾脏中识别的SRC-1的下调也得到了证实。考虑到上述结果，假定GR和Kocchi Violet的SRC-1在肾脏中进行了下降，因此对GC给药的影响不会过分持续。将来，可以通过检查SRC-1基因的启动子区域中是否存在GRE来清楚地机械上的下调。