酸素の活性化や活性酸素の無毒化を行なう銅含有酵素の触媒反応

含铜酶的催化反应，活化氧并解毒活性氧

基本信息

批准号：
01F00252
负责人：
櫻井武
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

平成14年度の研究において肝機能の臨床検査薬として利用されている不完全糸状菌Myrothecium verrucaria由来のビリルビンオキシダーゼの組換え体は天然型酵素と異なるフォームで発現していることを明らかにしたが,このフォームについてさらに詳しく検討した。その結果,タイプ2銅とタイプ3銅からなる三核銅部位において,水酸基がタイプ2銅と一方のタイプ3銅との間で架橋していることがわかった。あるいはこれらが還元された状態にあり,もう一つのタイプ3銅が磁気的に孤立してESRスペクトルで検出されていることがわかった。このESRシグナルは低分子系では観測されたことにない極めて異常なCu(II)由来のシグナルである。このような休止状態の相違にもかかわらず,組換え体は,天然型酵素と同様の反応を行い,酸素還元種が観測できることがわかった。また,反応のターンオーバーが一回完結すると,組換え体の酸素還元部位は天然型酵素と同じ状態に至ることがわかった。すなわち,休止状態の三核銅部位は,酵素反応中には存在しないフォームで存在していることがわかった。一方,ビリルビンオキシダーゼのミュータントを数種類作成した。タイプ1銅に配位したMetをGlnに変異させたところ,天然型酵素の反応では観測するのが困難な酸素還元種が容易に検出されることを見出したが,時間の関係上,予備データの取得にとどまった。また,マルチ銅オキシダーゼで保存されているAspが酸素還元種へのプロトンソースであると予測し,このアミノ酸のAla変異体を作成したところ,非配位性アミノ酸であるにも関わらず,三核銅部位には,平均1個しか銅が入らないことがわかった。この事実から,このAsp残基は酸素還元だけではなく酸素還元部位の構造形成にも重要であることがわかった。

在2002年的一项研究中，揭示了来自不完整的丝状真菌肉豆蔻肉芽素的重组胆红素氧化酶，用作肝功能的临床测试，以与天然酶的不同形式表达，并更详细地检查了这种形式。结果表明，将羟基在2型铜和三型铜之间进行了交联，该三核铜部位由2型铜和3型铜组成。或者，发现它们在还原状态下，另一种3型铜在ESR光谱中被磁分离并检测到。该ESR信号是在小分子系统中尚未观察到的非常异常的Cu（II）信号。尽管在静息状态上存在这种差异，但重组剂的反应与天然酶相同，发现可以观察到减少氧气的物种。还发现，一旦完成反应，重组的氧还原位点与天然酶的状态相同。也就是说，发现静止的三核铜位点以酶促反应过程中不存在的形式存在。同时，创建了几种类型的胆红素氧化酶突变体。当将MET与1型铜相协调为GLN时，发现可以很容易地检测到在天然酶反应中难以观察到的减少氧气的物种，但是由于时间限制，获得了初步数据。此外，我们预测，由多能氧化酶保守的ASP是降低氧气物种的质子来源，并创建了该氨基酸的ALA突变剂，并发现尽管是非协同氨基酸，但在平均水平上只有一个铜，但仅包含一个铜。这一事实表明，该ASP残基不仅对还原氧气很重要，而且对于形成还原位点的结构也很重要。