一酸化窒素還元から酸素還元への変換による呼吸酵素の分子進化

通过从一氧化氮还原到氧还原的转化呼吸酶的分子进化

基本信息

批准号：
16655069
负责人：
櫻井武
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

脱窒菌Halomonas halodenitrificansはヘムcを有する小サブユニットNorCと低スピンヘムb,高スピンヘムb_3および非ヘム鉄を有する大サブユニットNorBからなるヘテロダイマーコンプレックスである。大腸菌を宿主としてNorCを異種発現したところ,N末の膜アンカーが切断された状態で発現したが,ヘムcを含む部分には影響なく,電子移動機能を有していた。同様に,NorBを大腸菌を宿主として異種発現させたが,一酸化窒素還元機能は示さず,サブユニットの個別発現には成功しなかった。そこで,NorBの発現には,成熟酵素には存在しないORFがコードするNorQ, NorDが関係すると考え,この遺伝子も含めて発現系を構築したが,機能のある酵素は発現しなかった。次いで,H.halodenitrificans遺伝子がコードする総てのNOR遺伝子,NorC, NorB, NorQ, NorDを含んだ異種発現系を構築したところ,オーセンティックなNorと同じ吸収,MCD, ESRスペクトルを示す組換え体が得られた。この組換え体のNO還元活性を測定したところ,微弱ながら,活性を示し,世界で初めてNorの異種発現に成功した。次いで,Norが末端酸化酵素へと分子進化する過程を再現するため,非ヘム鉄を銅結合部位に変異させることを計画し,Norとチトクロムオキシダーゼのキメラ酵素の作成を試みたが,キメラ酵素は高次構造を適切にとることが出来なかった。この解決方法として,組換え体を点変異させることが計画されるが,異種発現体は酵素の収量が低いことから,研究期間内ではミュータントの作成までには至らなかった。異種及び同種発現によるミュータント作成は新しい大きなテーマとして設定する計画である。

硝化细菌卤素卤素是杂二聚体配合物，该复合物由具有血红素C的小亚基NORC和一个具有低自旋血红素B，高自旋血红素B_3和非血红素铁的大亚基NORB组成。当使用大肠杆菌作为宿主异源表达NORC时，将N末端膜锚裂解，但是包含血红素C的部分不受影响，并且具有电子传递函数。同样，NORB使用大肠杆菌作为宿主进行异源表达，但没有显示一氧化氮的减少功能，也没有成功地在亚基的个体表达中成功。因此，我们认为由成熟酶中不存在的ORF编码的NORQ和NORD参与NORB的表达，尽管我们构建了包括该基因在内的表达系统，但没有表达功能性酶。接下来，构建了包含由H. halodenitrificans基因，NORC，NORB，NORQ和NORD编码的所有NOR基因的异源表达系统，以获得表现出相同吸收的重组因子，MCD和ESR光谱作为正义。当测量该重组的无重组活性时，它表现出较弱的活性，并且是世界上第一个成功表达的活动。接下来，为了复制末端氧化酶的分子进化，我们计划将非血红素铁突变为铜结合位点，并试图为NOR和细胞色素氧化酶创建一种嵌合酶，但是嵌合酶无法正确地采用更高阶的结构。作为一种解决方案，计划将突变重组指向重组，但是由于异源表达的酶的产量低，因此在研究期内未产生突变体。计划通过异源和同源表达创建突变体是一个新的主要主题。