金属タンパク質をホロ化する金属シャペロンタンパク質の開発

开发将金属蛋白转化为全息体的金属伴侣蛋白

基本信息

批准号：
21655061
负责人：
櫻井武
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

金属シャペロン機能を示すことが期待される枯草菌のCotDの発現系を前年度構築したが,CotDは多数のシステイン残基を含むため空気酸化されやすく,単離出来なかった。今年度,大腸菌を宿主とする組換え体を培養・発現誘導した後,尿素と非イオン性界面活性剤TritonX-100で処理した後,沈殿をイオン性界面活性剤SDSと還元剤2-メルカプトエタノールで可溶化することによって精製することに成功した。CotDの銅(II)結合性を吸収および電子スピン共鳴スペクトルで調べたところ,銅(II)イオンはまず主鎖に結合した後,少なくとも2つのヒスチジン残基のイミダゾール基に結合することがわかった。1分子のCotAあたり5個以上の銅(II)イオンを結合できることから,CotDは期待通り極めて高い金属イオン結合能を有していることがわかった。しかしながら,CotDの単離条件の検討に時間を費やしたので,CotDのシャペロン機能の検討は,十分行えなかった。発表した論文はCueOの発現系にCotDを共発現させたものであるが,CotDの共発現効果は有為レベルではなかった。一般に金属タンパク質は組換え体が得られてもホロ化がネックとなり,タンパク質の有効利用に至らないことから,CotDの機能を検証する実験は次年度も継続する予定である。CotD機能の当面のターゲットとしているCotAの枯草菌での発現系の改良については,様々の分泌シグナルの利用に挑戦したが芳しい結果は得られなかった。また,高発現の妨げになる可能性のあるループに存在するプロリン残基に変異導入したが,CotAの発現量や機能には大きな変化はなかった。今後は,CotDのCu(II)シャペロン機能を分子レベルでより詳細に調べるとともに,銅以外の金属イオンのシャペロン機能についても検討する予定である。

我们已经在枯草芽孢杆菌中构建了COTD的表达系统，该系统预计将表现出金属伴侣的功能，但是COTD易于空气氧化，因为它包含大量的半胱氨酸残基，无法分离。今年，在用大肠杆菌作为宿主培养和诱导重组，并用尿素和非离子表面活性剂Tritonx-100对其进行处理，并通过用离子表面活性剂SDS溶解其成功纯化沉淀物，并减少了2-甲醇。通过吸收和电子自旋谐振光谱研究了COTD结合特性，发现铜（II）离子首先键与主链，然后与至少两个组氨酸残基的咪唑基团结合。由于每个分子COTA可以结合5个或更多的铜（II）离子，因此发现COTD如预期的那样具有极高的金属离子结合能力。但是，随着时间研究COTD的隔离条件的时间，COTD的伴侣函数还不够。发表的论文在CUEO表达系统中共表达的COTD，但是COTD的共表达效应并不是显着的。通常，即使获得了金属蛋白，也是一个问题，也无法有效利用该蛋白质，因此实验验证COTD的功能将在明年继续进行。关于枯草芽孢杆菌中COTA的表达系统的改善，这是COTD功能的直接目标，我们试图利用各种分泌信号，但没有取得良好的结果。此外，尽管将诱变引入了一个循环中存在的脯氨酸残基中，但可能会干扰高表达，但COTA的表达水平或功能没有显着变化。将来，我们将在分子水平上更详细地研究CU（II）COTD的伴侣功能，我们还将考虑除铜以外的金属离子的伴侣功能。