必須微量元素セレンを運搬する蛋白質の同定と運搬機構の解析

必需微量元素硒转运蛋白的鉴定及转运机制分析

• 批准号: 12878113
• 负责人: 高橋 和彦
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12878113/
• 关键词: セレン; 必須微量元素; 細胞増殖

Jurkat細胞の培養に用いられる無血清培地には,Seが亜セレン酸ナトリウムの形で添加されており,Seの添加は細胞,特に免疫系や神経系の細胞の生存維持に必須である.一方,血清添加培養ではSeの添加が不要なことから,血清中にはSeを運搬して細胞にSeを供給する因子が存在すると予想された.これまでの研究から,ヒト血清には2種のSe含有蛋白質が存在することが分かっていたので,このうちいずれがSe運搬作用を有するか欠乏血清を用いて同定した.これらの欠乏血清存在下にJurkat細胞を培養し,いずれの欠乏血清で細胞がSe欠乏になるかを調べた.細胞のSe含量や細胞内のSe含有酵素の活性を測定したところ,Selenoprotein P(SeP)欠乏血清を用いて培養した細胞の場合のみSe含量,cGPx活性,チオレドキシン還元酵素活性の低下が認められたSe欠乏細胞をSePを再添加したSeP欠乏培地で培養し,cGPx活性を測定したところ,添加したSePの濃度に依存したcGPx活性の回復が認められた.以上の研究から,SePがSe運搬蛋白質であることが明らかになった.Se運搬蛋白質を同定できたので,次に細胞への結合様式,取り込み機構について研究を行った.Se75を添加した培地で肝細胞腫Hep-G2を培養し,放射標識SePを培養上清から回収した.抗体を不溶化したカラムを用いて,放射標識SePを調製した.Jurkat細胞に可変量の放射標識SePを加え,細胞への結合量を測定し,スキャッチャードプロットから,受容体数,解離定数を求めた.Jurkat細胞上の受容体数は2,200,解離定数は0.67nMであった.また,放射標識SePと細胞を反応後,架橋試薬を加え,SDS-PAGEで解析したところ,分子量100KのSeP結合分子の存在が明らかになった.

将SE添加到用于硒酸钠形式培养Jurkat细胞的无血清培养基中，而SE的添加对于维持细胞的存活至关重要，尤其是免疫系统和神经系统。但是，由于在血清添加的培养物中不需要添加SE，因此可以预测，有些因素将SE和SE载为细胞。先前的研究表明，人血清中存在两种类型的含SE的蛋白质，其中哪种具有SE-Transporting效应的作用，使用缺乏血清鉴定出。在存在这些缺乏血清的情况下培养了Jurkat细胞，并且确定了哪些细胞在缺乏的血清中变得缺陷。当测量细胞的SE含量和细胞中含Se的酶的活性时，发现硒蛋白。仅在使用P（SEP）缺乏血清培养的细胞中，在SEP缺陷培养基中培养SE缺陷细胞，该培养基的SEP缺陷降低，并且观察到硫氧还蛋白还原酶的活性。当测量CGPX活性时，根据添加的SEP的浓度恢复CGPX活性。从上述研究中，揭示了SEP是一种SE-Transport蛋白。由于确定了SE-Transport蛋白，因此我们接下来对结合模式和摄取机制进行了研究。肝细胞瘤他正在补充SE75的培养基中。培养P-G2，并从培养物上清液中回收了放射性标记的SEP。使用一柱制备放射性标记的SEP，其中抗体被不均能化。将可变量的放射性标记的SEP添加到Jurkat细胞中，并测量与细胞的结合量，并根据Scatchard的图确定受体数量和分离常数。 Jurkat细胞上的受体数量为2200，解离常数为0.67 nm。此外，在将放射性标记的SEP与细胞反应后，添加了交联试剂，SDS-PAGE分析显示出存在100K分子量的SEP结合分子。

项目成果

Sakai, Masatoshi: "Enhancement of FcgR- and CR3-mediated neutrophil phagocytosis by cerebrosides."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 278・1. 79-83 (2000)

Sakai，Masatoshi：“脑苷脂对 FcgR 和 CR3 介导的中性粒细胞吞噬作用的增强”。Biochem.Biophys.Res.Commun. 278・1（2000）。

Saito, Yoshiro: "Production and application of monoclonal antibodies to human selenoprotein P"J. Health Sci.. 47・4. 346-651 (2001)

Saito, Yoshiro：“人硒蛋白P单克隆抗体的制备和应用”J. Health Sci. 47・4（2001）。

高橋 和彦: "selenoprotein Pの構造上のユニークな特徴とその機能"生化学. 73・3. 261-264 (2001)

高桥和彦：“硒蛋白P的独特结构特征及其功能”生物化学73・3（2001）。

Saito, Yoshiro: "Selenoprotein P : its structure and function."J.Health Sci.. 46・6. 409-413 (2000)

Saito, Yoshiro：“硒蛋白P：其结构和功能。”J.Health Sci.. 46・6（2000）。

Yarimizu, Junko: "Efficiency of selenocysteine incorporation in human thioredoxin reductase."Antioxidants and Redox Signaling. 2・4. 643-651 (2000)

Yarimizu，Junko：“硒代半胱氨酸掺入人硫氧还蛋白还原酶的效率”。抗氧化剂和氧化还原信号传导2·4（2000）。