DREAMによるカルシトニン遺伝子の転写機構の解明

DREAM阐明降钙素基因转录机制

基本信息

批准号：
12877298
负责人：
平田雅人
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877298/
关键词：
カルシトニン転写因子カルシウム EFハンドモチーフ甲状腺

项目摘要

ヒト脳mRNAよりRT-PCR法にてDREAM/calsenilin cDNAのクローニングを行った。得られたcDNAをもとにDREAMの野生型、及びC末端側に存在するCa2+結合モチーフ(EF-ハンド)に点変異を与えた変異型、それぞれの大腸菌発現系を構築し両組み換え蛋白質を発現、精製した。調製した蛋白質とCa2+との結合能を45Ca2+オーバーレイ法を用いて確認した。野生型DREAMは、Ca2+と結合したが、変異体では結合は見られなかった。次にプロダイノルフィン遺伝子上に存在するDRE配列と調製したDREAMとの結合をEMSA法によりCa2+濃度を変えて検討した。野生型DREAMでは高Ca2+濃度下でDRE配列との結合が見られなくなったが、変異型ではDRE配列に結合したままであった。以上より調製したDREAM蛋白質とDNAのDRE配列との結合がEF-ハンドへのカルシウム結合能に依存することが確認できた。次に甲状腺髄様癌由来の細胞株(TT cell)を用いてカルシトニン(CT)分泌調節へのDREAMの関与を調べた。RT-PCR法でTT cellがDREAMを内在性に発現していることを確認した。このTT cellに野生型及び変異型DREAMの哺乳類細胞発現ベクターさらに、DREAMのセンスおよびアンチセンスmRNAを発現するベクターも構築し、それぞれでTT細胞を形質変換した。発現したDREAMは細胞内で均一に分布していた。アンチセンスを発現させた細胞においては対照細胞やセンス発現細胞と比較してDREAMの発現抑制が認められたとともにA23187刺激によるCT分泌量が低下していた。また、変異型DREAMを導入したTT細胞でもCT分泌が減少した。これらのことから、甲状腺でのCTの発現、分泌にDREAMが関わっていることが示唆された。

使用 RT-PCR 从人脑 mRNA 中克隆 DREAM/calsenilin cDNA。基于获得的cDNA，我们构建了野生型DREAM和C末端Ca2+结合基序(EF-hand)点突变的突变型的大肠杆菌表达系统，并表达了两种重组蛋白。，纯化。使用45Ca2+叠加法证实了制备的蛋白质与Ca2+的结合能力。野生型 DREAM 结合 Ca2+，但在突变体中未观察到结合。接下来，我们通过使用 EMSA 方法改变 Ca2+ 浓度来研究强啡肽原基因上存在的 DRE 序列与制备的 DREAM 之间的结合。在高Ca2+浓度下，野生型DREAM不再与DRE序列结合，但突变型仍与DRE序列结合。由上可知，制备的DREAM蛋白与DNA的DRE序列的结合依赖于EF-hand的钙结合能力。接下来，我们使用源自甲状腺髓样癌（TT 细胞）的细胞系研究了 DREAM 在降钙素（CT）分泌调节中的作用。 RT-PCR证实TT细胞内源表达DREAM。在这些TT细胞中构建野生型和突变型DREAM的哺乳动物细胞表达载体以及表达DREAM有义和反义mRNA的载体，并用每种载体转化TT细胞。表达的DREAM均匀分布在细胞内。在表达反义的细胞中，与对照细胞和表达有义的细胞相比，DREAM表达受到抑制，并且A23187刺激后CT分泌量减少。转染突变体 DREAM 的 TT 细胞中 CT 分泌也减少。这些结果表明DREAM参与甲状腺中CT的表达和分泌。