中枢神経系におけるイノシトール1,4,5-三リン酸結合蛋白

中枢神经系统中的肌醇 1,4,5-三磷酸结合蛋白

基本信息

批准号：
08270233
负责人：
平田雅人
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

中枢神経系における分子量130-kDaの新規イノシトール1,4,5-三リン酸[Ins(1,4,5)P_3]結合蛋白質の機能を解明するためのステップとして以下の実験を行った。1.本分子はホスホリパーゼC-δ_1(PLC-δ_1)とアミノ酸配列上は類似しているものの触媒活性を持っていない。その原因を活性中心のアミノ酸配列の変異にあるのではないかと考え、PLC-δ_1の活性中心と考えられているX-領域やY-領域を130-kDa分子の相当領域と置き換えた、リコンビナント蛋白を作製するためのプラスミドを作製した。遺伝子配列は確認したので、今後大腸菌で過剰発現させ、活性測定などの実験を行う。2.本分子の遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子とともに組み込んだプラシミドをCOS-1細胞にトランスフェクトした。抗生剤存在下でクローニングすることにより、本分子を安定に発現する細胞の作製に成功した。7回膜貫通型受容体刺激や成長因子刺激にもとづく細胞機能の修飾現象を検討して、本分子の細胞内機能を推定していく。3.本分子もPLC-δ_1と同じくプレックストリン相同領域(PHドメイン)を有した蛋白質である。どの領域がイノシトールリン酸結合領域であるのかを検討するため、本分子のさまざまな部分が欠失するように種々の遺伝子を作製し、COS-1細胞にトランスフェクトした。それぞれについて細胞上清の[^3H]Ins(1,4,5)P_3結合を測定したところ、PHドメインを欠いた分子が結合活性を欠いていたので、結合領域をPHドメインに帰納できた。また、Ins(1,4,5)P_3のみならずIns(1,4,5,6)P_4も結合することが分かった。これらの結果から、種々の蛋白質にあるPHドメインはそれぞれ固有のイノシトールリン酸を結合することによりその機能を発揮するのではないかと提案した。

进行以下实验是为了阐明分子量为 130 kDa 的新型肌醇 1,4,5-三磷酸 [Ins(1,4,5)P_3] 结合蛋白在中枢神经系统中的功能。 1.虽然该分子的氨基酸序列与磷脂酶C-δ_1（PLC-δ_1）相似，但它不具有催化活性。我们推测原因可能是活性中心的氨基酸序列发生突变，并创建了一种重组蛋白，其中被认为是PLC-δ_1活性中心的X区和Y区被替换与 130-kDa 分子的相应区域一起创建质粒以创建 .现在基因序列已经确认，我们将在大肠杆菌中过表达它并进行测量活性等实验。 2.用含有该分子基因和新霉素抗性基因的质粒转染COS-1细胞。通过在抗生素存在下进行克隆，我们成功地创造了稳定表达该分子的细胞。我们将通过检查基于七次跨膜受体刺激和生长因子刺激的细胞功能的改变现象来估计该分子的细胞内功能。 3. 与PLC-δ_1一样，该分子也是具有pleckstrin同源区（PH结构域）的蛋白质。为了研究哪个区域是肌醇磷酸结合区域，我们创建了各种基因，删除了该分子的各个部分，并将它们转染到 COS-1 细胞中。当测量每个细胞上清液中的[^3H]Ins(1,4,5)P_3结合时，缺乏PH结构域的分子缺乏结合活性，因此结合区域可以归因于PH结构域。还发现不仅Ins(1,4,5)P_3而且Ins(1,4,5,6)P_4也结合。基于这些结果，我们提出各种蛋白质中的 PH 结构域通过结合独特的磷酸肌醇发挥其功能。