細胞形質を指標とした疾患関連遺伝子単離・同定法の開発

以细胞性状为指标的疾病相关基因分离和鉴定方法的开发

• 批准号: 12204014
• 负责人: 畠山 昌則
• 金额: --
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12204014/
• 关键词: 部位特異的リコンビナーゼ; Kwリコンビナーゼ; レトロウイルスベクター; 外来遺伝子発現誘導系; プロウイルス; サイトカイン; Bリンパ球; 増殖因子依存性

ゲノム情報が急速に蓄積されつつある現在、その情報が本来有する生物活性の迅速な同定ならびにゲノム多型情報に対応する生物活性定量法の開発は重要な意義をもつ。本研究は、特定の細胞形質発現をつかさどる遺伝子群を(1)細胞への効率良いcDNA発現ライブラリーの導入(2)目的とする細胞形質を獲得した細胞の選択・選別(3)部位特異的リコンビナーゼによるcDNAの染色体からの切り出し・回収(4)回収されたcDNAの再導入による細胞の再形質転換から構成される過程を繰り返すことにより、迅速かつ包括的に濃縮・単離する系を樹立することを目的とした。まず、テトラサイクリンならびにIPTGの二重制御を受ける誘導発現プロモーター(TcIPプロモーター)の下流に酵母由来の部位特異的リコンビナーゼであるKwリコンビナーゼ遺伝子を接続し、インターロイキン3(IL-3)依存性リンパ系細胞株BaF3に安定的に導入した。得られたトランスフェクタントから、IPTG添加によりKwリコンビナーゼを誘導発現する安定変異細胞株BaF/Kwを樹立した。次に、BaF3細胞株から調整したpolyA(+)RNAを用いてcDNAライブラリーを作製し、レトロウイルスベクター(MarX)に組み込んだ。MarXベクターは3′LTR内にKwリコンビナーゼの認識配列が挿入されており、プロウイルスとして宿主ゲノム内に組み込まれたcDNAはKwリコンビナーゼによりゲノムから選択的に切り出される。同ベクターにBaF3由来cDNAを挿入し、約130万個の独立cDNAから構成される発現ライブラリーを作製した。今後は、BaF/Kw細胞へのウイルス感染によるcDNAライブラリーの導入ならびにIL-3非依存性細胞選択の後、リコンビナーゼ発現依存的にIL-3非依存性増殖能が喪失するcDNAの選択を行う。

当前，基因组信息正在迅速积累，并且开发了量化生物学活性的方法，该方法固有地具有与基因组多态性信息相对应的生物学活性的固有和量化生物学活性。这项研究旨在通过重复（1）将特定细胞性状表达的基因组组成的过程来建立一种用于快速而全面的富集和隔离系统，（1）将特定细胞性状的表达控制在细胞中，（2）选择和分类细胞，这些细胞通过使用定位的细胞从染色体中恢复所需的细胞性状，（3）通过探索染色体从染色体中恢复和（4）恢复cDNA，并恢复cDNE酶，并（4）恢复（4）。首先，一种衍生自酵母的位点特异性重组酶的KW重组酶基因被诱导表达启动子（TCIP启动子）的下游连接，受到对四环素和IPTG的双重控制，并稳定地引入了白介素3（IL-3） - 依赖性淋巴样细胞系BAF3。从所得的转染剂中，建立了通过添加IPTG诱导并表达KW重组酶的稳定突变细胞系BAF/KW。然后使用从BAF3细胞系制备的Polya（+）RNA制备cDNA文库，并掺入逆转录病毒载体（Marx）中。马克思载体具有插入3'LTR中的KW重组酶的识别序列，而将cDNA插入了宿主基因组中，因为KW重组酶从基因组中选择性切除了病毒。将载体插入了BAF3衍生的cDNA中，以产生一个由约130万个独立cDNA组成的表达式库。将来，在通过病毒感染引入cDNA库中的cDNA库中，并选择了IL-3独立的细胞，以重新组合酶表达依赖性方式的选择失去其IL-3独立的增殖潜力的CDNA的选择。

项目成果

Hatakeyama.M: "Collective Inhibition of pRB Family Proteins by Phosphorylation in Cells with p16^<INK4a> Loss or Cyclin E Overexpression."The journal of biological chemistry. (in press). (2001)

Hatakeyama.M：“p16^<INK4a> 丢失或细胞周期蛋白 E 过度表达的细胞中磷酸化对 pRB 家族蛋白的集体抑制。”生物化学杂志。

Hatakeyama.M: "Ras and STAT are essential and sufficient downstream components of JAKs in cell proliferation"Japanese Journal of Cancer Research. 93. 527-533 (2000)

Hatakeyama.M：“Ras 和 STAT 是 JAK 在细胞增殖中必需且充分的下游成分”，《日本癌症研究杂志》。

Hatakeyama.M: "Identification and Characterization of Elongin A2, a new member of the elongin family of transcription elongation factors, specifically expressed in the testis."The journal of biological chemistry. 275. 6546-6552 (2000)

Hatakeyama.M：“Elongin A2 的鉴定和表征，Elongin A2 是转录延伸因子 elongin 家族的新成员，在睾丸中特异性表达。”生物化学杂志。

Hatakeyama.M: "β 3-endonexin as a novel inhibitor of cyclin A-asssociated kinase."Biochemical and biophysical research communications. 267. 947-952 (2000)

Hatakeyama.M：“β 3-内毒素作为细胞周期蛋白 A 相关激酶的新型抑制剂。”生物化学和生物物理研究通讯。 267. 947-952 (2000)